Structural characterization of the human immune response to the meningococcal vaccine antigen NHBA

Neisseria meningitidis is a human pathogen which can cause fatal sepsis and invasive meningococcal disease once it reaches the blood stream and the nervous system. Bexsero™ is the first broadly protective multicomponent vaccine against serogroup B N. meningitidis. Among itscomponents, the Neisserial Heparin Binding Antigen (NHBA) represents the less structurally and functionally characterized antigen of Bexsero and therefore has been the target of the current study.NHBA is a surface-exposed lipoprotein composed by two domains (C- and N-terminal), and while the structure of the C-terminal domain was solved by NMR, the structure of N-terminal region is still unknown and predicted to be largely unstructured. Knowledge of the NHBA full-length structure canprovide important insights towards the understanding of its biological function, as well as on its role as vaccine antigen.In this work we combined the information derived from the profiling the B-cell repertoire in response to vaccination with Bexsero with structural biology, in order to shed light on NHBA structure and on the molecular bases of its recognition by the human immune system. By using fragments antigen binding (Fabs) derived from human monoclonal antibodies (mAbs), we sought to provide highresolution epitope mapping of the NHBA immunogenic regions, which in turn could permit a deeper characterization of the molecular determinants of antibody binding and protective epitopes. Here we present a structural characterization of the first high-resolution crystal structures of three free human anti-NHBA Fabs of NHBA. These structures reveal features compatible with the binding of NHBA regions as previously determined by other low-resolution methods. Moreover, these Fabs provided important tools for structural studies through co-crystallization experiments with various NHBA fragments and constructs. While using Fabs that bind to the NHBA N-terminal region complexed with full length or sub-full length antigen did not result in crystal growth, a construct including solely the C-terminal domain yielded crystals that allowed solving the structure of the complex with a C-terminal Fab binder. Structural analysis highlighted the conservation of the epitope and lead to the identification of the key residues involved into NHBA-Fab recognition. Additionally, the comparison between bound and unbound Fab revealed an interesting fitting mechanism occurring during antigen recognition that provides further details into the elucidation of antibody binding. Combined together, these results enhance our structural and biophysical understanding of NHBA, and provide a platform for deeper analyses aimed at the elucidation of the molecular determinants of its immunogenicity.

Neisseria meningitidis è un patogeno umano obbligato e un potenziale agente eziologico di sepsi e meningite, qualora entri in contatto con il flusso sanguigno o il sistema nervoso. Bexsero è il primo vaccino multicomponente in grado di fornire ampia protezione contro il sierogruppo B di N meningitidis. Tra i vari componenti di Bexsero, Neisserial Heparin Binding Antigen (NHBA) rappresenta l’antigene meno caratterizzato sia funzionalmente che strutturalmente e, per questa ragione, è stato selezionato come oggetto di studio nel presente lavoro. NHBA è una lipoproteina esposta sulla superficie del batterio e si compone di due domini (C- e N-terminale); mentre la struttura del dominio C-terminale è stata risolta tramite spettroscopia NMR, il dominio N-terminale è ancora strutturalmente non caratterizzato e predetto, per la maggior parte della sua sequenza, come non strutturato. La conoscenza delle caratteristiche strutturali della proteina intera, quindi, potrebbe essere utile per chiarire il ruolo che NHBA svolge sia dal punto di vista biologico sia come antigene vaccinale. In questo lavoro di tesi, informazioni derivanti dall’analisi del repertorio delle cellule B generate in risposta all’immunizzazione con Bexsero sono state combinante con tecniche di biologia strutturale (cristallografia a raggi X), in modo da delucidare la struttura completa di NHBA e le basi molecolari del suo riconoscimento da parte del sistema immunitario umano. Frammenti di anticorpi leganti l'antigene (Fabs), derivanti da anticorpi monoclonali umani (mAbs) sono stati utilizzati per la mappatura ad altarisoluzione degli epitopi immunogenici di NHBA, permettendo un’accurata caratterizzazione dal punto di vista molecolare delle regioni dell’antigene implicate nel legame con gli anticorpi. Dall’analisi delle strutture cristallografiche ad alta risoluzione di tre Fabs umani diretti controNHBA, è emerso che questi presentano a livello del paratopo caratteristiche che indicano la loro compatibilità con il legame a NHBA tramite regioni precedente mappate con tecniche a bassa risoluzione. Inoltre, questi Fabs si sono rivelati un importante strumento per studi strutturali attraverso esperimenti di co-cristallizzazione in complesso con NHBA. Purtroppo non è stato possibile ottenere cristalli idonei per esperimenti di diffrazione dalla co-cristallizzazione dei Fabs con l’intera NHBA o frammenti N-terminali di NHBA; al contrario, il dominio C-terminale dell’antigene in complesso con un Fab ha generato cristalli che hanno permesso di risolvere la prima struttura di un complesso tra Cterminale di NHBA e un Fab umano. L’analisi strutturale di questo complesso ha evidenziato l’estrema conservazione dell’epitopo e guidato l’identificazione dei residui chiave implicati nel riconoscimento tra NHBA e Fab. Inoltre, il confronto tra la forma complessata e non-complessata del Fab ha rivelato un 8 interessante meccanismo di legame che avviene nella fase di riconoscimento dell’antigene e che fornisce ulteriori dettagli sui meccanismi che regolano i legami tra anticorpi e antigeni. I risultati ottenuti in questo studio hanno contribuito a migliorare la conoscenza strutturale e biofisica di NHBA e forniscono una base per una futura analisi strutturale più accurata, volta a delucidare i dettagli molecolari della risposta immunitaria a NHBA.