Molecular basis of the interactions between carbohydrate antigens and monoclonal antibodies

Carbohydrate-based vaccines induce an immune response against surface glycans found on pathogenic bacteria and are used to protect children from meningitis and other bacterial diseases. The definition of the epitope targeted by protective antibodies is a crucial information for the design, description and even registration of glycoconjugate vaccines. The aim of this project is the characterization at atomic level of the interaction between Group B Streptococcus (GBS) oligosaccharides with functional antibodies mediating bacterial phagocytic killing. The specificity of anti-GBS type III polysaccharide (GBS PSIII) antibodies has been ascribed to a conformational epitope with an extended helical structure which would be formed by multiple repeating units. Here fragments of GBS PSIII were obtained by chemical synthesis and by sizing of the native polysaccharide from bacterial source. The oligosaccharides (OSs) were purified by ion exchange chromatography and were characterized by mass spectrometry, HPLC and NMR analysis. First, the obtained OSs were used to characterize the interaction to protective anti PSIII rabbit monoclonal antibody (mAb) by competitive ELISA and surface plasmon resonance analysis. The dependence of binding affinity on oligosaccharide length was confirmed and the minimal structures showing comparable binding to full-length PS III were identified. Next, a combination of saturation transfer difference NMR (STD-NMR) and X-ray crystallography was used to map at atomic level the interactions in the rabbit mAb-OS complex. The challenging crystallization of the carbohydrate-protein complex was achieved and the molecular bases of the antigen-antibody interaction were unveiled. The obtained results were used to optimize a vaccine based on short GBS PSIII fragments.

I vaccini basati su carboidrati inducono una risposta immunitaria contro i glicani della superficie di patogeni e sono usati per proteggere i bambini da meningite e altre malattie batteriche. La definizione dell’epitopo riconosciuto da anticorpi protettivi è un’informazione cruciale per il design e la registrazione di questi vaccini gliconiugati. L’obiettivo di questo progetto è la caratterizzazione a livello atomico dell’interazione tra oligosaccaridi derivanti dalla capsula di Group B Streptococcus (GBS) e anticorpi funzionali che quindi inducono la fagocitosi del batterio. La specificità degli anticorpi verso il polisaccaride del GBS di serotipo III (GBS PSIII) è stata attribuita ad un epitopo conformazionale formato da un’estesa elica che si forma quando si hanno un certo numero di unità saccaridiche che si ripetono nella struttura. In questo progetto, i frammenti di GBS PSIII sono stati ottenuti sia per sintesi chimica sia tramite depolimerizzazione del polisaccaride nativo estratto dalla capsula del batterio. Gli oligosaccaridi (OSs) sono stati purificati tramite cromatografica a scambio ionico e sono stati caratterizzati tramite spettrometria di massa, HPLC e analisi NMR. Inizialmente gli OSs ottenuti sono stati utilizzati per caratterizzare l’interazione di un anticorpo monoclonale (mAb), prodotto in coniglio, protettivo e specifico per PSIII, attraverso studi di competitive ELISA e SPR. In seguito, una combinazione di tecniche diverse, tra cui saturation transfer difference NMR (STD-NMR) e cristallografia a raggi X, è stata utilizzata per mappare a livello atomico l’interazione tra il mAb di coniglio e un OS selezionato sulla base delle analisi precedenti. La riuscita cristallizzazione del complesso carboidrato-proteina ha permesso di rivelare le basi molecolari dell’interazione antigene-anticorpo. I risultati ottenuti sono stati quindi utilizzati per ottimizzare un vaccino basato su frammenti corti del GBS PSIII.