Functional characterization of AtTPK3 potassium channel of Arabidopsis thaliana

My Ph.D. project has focused on the characterization of TPK3, a putative channel selective for potassium (K+) with a predicted chloroplast localization in higher plants, from biochemical, physiological and electrophysiological point of view. This protein belongs to the TPK channel family (from Tandem-Pore K+ channels) and displays amino acid sequence homology with another K+ channel studied in our laboratory, called SynK (Zanetti et al., 2010). SynK shows thylakoid localization in Cyanobacteria. The SynK channel has been shown to be critical for photosynthetic performances in Cyanobacteria, given the photosensitive phenotype displayed by the mutants lacking the SynK protein. Given the homology, we hypothesized that similarly, TPK3 might be involved in the regulation of photosynthetic processes in higher plants. So far, no information is available about the properties of TPK3, nor about its physiological roles, neither about its possible involvement in photosynthesis; the work presented in this thesis had the aim of clarifying some important aspects of the functions of TPK3. Following subcellular localization studies carried out using biochemistry and confocal microscopy techniques, the TPK3 channel was expressed in E. coli cells for subsequent electrophysiological characterization in a planar lipid bilayer setup in order to prove its function as K+ channel. The unavailability of commercial mutants for tpk3 gene required setting up of a silencing procedure via RNA interference of the messenger for the protein, in order to analyze the possible physiological roles of TPK3. The resulting silenced plants have been studied under different growth conditions to determine changes in physiology of the plants including their photosynthetic parameters. In parallel with the TPK3 project, the most important part of my Ph.D., I also followed two other major areas of research: one concerning the study of the functions of two members of plant Glutamate Receptors (GluRs) and the other one concerning the characterization of the plant homologous of the recently identified MCU (Mitochondrial Calcium Uniporter) of mammals. This thesis also includes a manuscript (Checchetto et al., 2012) to which I contributed with the heterologous expression of a calcium-activated K+ channel, SynCaK, of Cyanobacteria.

Il mio progetto di dottorato si è focalizzato sulla caratterizzazione, dal punto di vista biochimico ed elettrofisiologico, di una proteina denominata TPK3 che è predetta di funzionare come canale selettiva per il potassio (K+) ed essere localizzata nei cloroplasti nelle piante superiori,. Questa proteina appartiene alla famiglia dei canali TPK (da Tandem-Pore K+ channels) e mostra omologia di sequenza a un altro canale del K+ studiato nello stesso nostro laboratorio, denominato SynK (Zanetti et al., 2010), a localizzazione tilacoidale ed appartenente al phylum dei Cianobatteri. È stato dimostrato in più esperimenti che il canale SynK è fondamentale per la regolazione della fotosintesi nei Cianobatteri, in considerazione del fenotipo fotosensibile mostrato dai mutanti per il gene synk. Visto la localizzazione predetta del TPK3, è stato ipotizzato in partenza che TPK3 potesse svolgere un ruolo simile nelle piante superiori. Finora nulla si conosceva sulle proprietà di TPK3, ne sui suoi ruoli fisiologici, ne su di un suo eventuale coinvolgimento nella fotosintesi nelle piante superiori; il lavoro contenuto nel progetto presentato ha cercato di chiarire alcuni aspetti salienti delle funzioni di TPK3. Dopo studi di localizzazione subcellulare condotti con tecniche di biochimica e microscopia confocale, il canale TPK3 è stato espresso in E. coli per la successiva caratterizzazione elettrofisiologica in bilayer lipidico planare allo scopo di determinare la sua funzione come canale di K+. L’assenza di mutanti commerciali per il gene tpk3 ha necessitato la messa a punto del suo silenziamento tramite RNA interference del messaggero per la proteina suddetta, al fine di analizzarne i possibili ruoli fisiologici. Le piante silenziate risultanti, sottoposte a differenti condizioni di crescita, sono state studiate in vari esperimenti atti a determinarne vari parametri inclusi quelli fotosintetici. Contemporaneamente allo studio del TPK3, quello di maggior rilievo nel mio dottorato, ho seguito anche altri due filoni di ricerca principali, riguardanti l’uno l’approfondimento delle funzioni di due membri dei Recettori di Glutammato vegetali (GluRs) e l’altro la caratterizzazione degli omologhi del recentemente identificato MCU (Mitochondrial Calcium Uniporter) di Mammiferi. Nella presente tesi è inoltre incluso un manoscritto (Checchetto et al., 2012) per il quale ho collaborato nell’espressione eterologa del canale di K+ calcio-dipendente (SynCaK) di Cianobatteri.