Utilità della tecnica denaturing high performance liquid chromatography per la diagnosi di deficit di mevalonato chinasi nelle febbri periodiche di sospetta natura autoinfiammatoria

Mevalonate Kinase Deficiency (MKD) is a rare autosomic recessive autoinflammatory disorder characterized by recurrent fever and musculoskeletal manifestations. MKD is due to mutations in the gene for mevalonate kinase (MK), located on chromosome 12q24, which cause variable degrees of enzyme deficiency. Although genetic investigation became essential for the diagnosis, especially in patient with normal IgD values in serum, the analysis of the sequence of the whole coding region is expensive: determination of mutations by sequencing can be made more efficient using techniques of pre-screening able to identify the mutated exon. OBJECTIVES: In this study we have developed a genetic investigation using Denaturing High Performance Liquid Chromatography (DHPLC), a pre-screening technique which is able to identify polymorphisms of the gene mvk in patients with autoinflammatory syndrome suspicion. METHODS: Starting from January 2007 we evaluated 10 healthy controls and 19 patients (mean age 33 years, range 13 – 61 years) affected by recurrent fevers and other clinical manifestations usually found in autoinflammatory syndromes and not correlated with infections or autoimmune disease. IgD level was measured in all patients. Molecular testing was performed in DNA extracted from peripheral blood lymphocytes by standard methods. The 10 coding exons (from 2 to 11) of the mvk gene were analysed by means of denaturing high-performance liquid chromatography (DHPLC) using the Wave® Fragment Analysis system (Transgenomic). Primers for PCR amplifications, amplicon lengths and PCR conditions were designed in our laboratory. Melting temperature (Tm) were calculated with Navigator Software 1.7.0 (Transgenomic). Sequences of the same amplified fragments were determined by means of an automatic sequencer ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (APPLIED BIOSYSTEMS). RESULTS: IgD level was normal in 14 patients. Healthy controls did not show any alteration of the DHPLC-profiles and of the DNA sequences. Twelve patients had at least one altered DHPLC-profile and these data have been confirmed by sequencing. In particular we detected the mutations S52N (patient 2-13-15), S135S (pt 13-16), D170D, c.632-18A>G(pt 4-5-6-10-12-17-19), c.78+61A>G (pt 6-11-19), c.885+24G>A (pt 6-19) already described in literature and in the database INFEVERS (http://fmf.igh.cnrs.fr/infevers). The screening with DHPLC has allowed us to get the results in shorter time (10 hours/patient) and with lower cost (40 euro / patient) in comparison to direct sequencing (time: 25 hours / patient and cost: 150 euro / patient). CONCLUSION: High serum levels of IgD do not represent an essential marker for diagnosis of MKD, as already reported in literature. DHPLC is a rapid low cost technique in order to screen mutations in patients with MKD suspicion. Nevertheless, being an indirect tecnique, DHPLC is able to show a polymorphism in the DNA sequence but it is not able to identify the position, and this still remains a limiting factor for the use of the DHPLC as an exclusive technique for genetic analysis. Twelve patients of our cohort carried at the same time D170D and c.632-18A>G: such event suggests that these SNPs could be in linkage disequilibrium and that such mutations could induce a diminution in the activity of the MK predisposing therefore to the MKD.

SCOPO DEL LAVORO La Mevalonate Kinase Deficency (MKD), già nota come sindrome da Iper IgD (HIDS), è una rara malattia autoinfiammatoria di tipo autosomico recessivo caratterizzata da febbre ricorrente e disturbi muscoloscheletrici. La MKD è dovuta a mutazioni del gene mvk, mappato sul cromosoma 12q24, il quale codifica per l’enzima mevalonato chinasi (MK); polimorfismi nel gene mvk sono la causa di un’alterata attività enzimatica di MK. L’individuazione della mutazione genica della mevalonato chinasi ha reso l’indagine genetica indispensabile per la diagnosi, soprattutto in pazienti con valori sierici di IgD normali, tuttavia il sequenziamento dell’intera regione codificante è costoso e la determinazione di mutazioni può essere resa più efficiente utilizzando tecniche di pre-screening in grado di identificare l’esone mutato. In questo studio è stata effettuata un’indagine genetica utilizzando l’analisi in DHPLC come tecnica di pre-screening per identificare le alterazioni nella regione codificante del gene mvk in pazienti con sospetta sindrome autoinfiammatoria. MATERIALI E METODI: A partire da gennaio 2007 sono stati presi in esame 19 pazienti (età media 33 anni, range 13 – 61 anni) seguiti presso la Cattedra e UOC di Reumatologia dell’Università di Padova per febbri ricorrenti non imputabili ad infezioni o a malattie autoimmuni e compatibili con sospetta MKD e 10 controlli sani. In ogni paziente è stato effettuato il dosaggio delle IgD nel siero. L’analisi del DNA, estratto da linfociti del sangue periferico, è stata effettuata mediante un protocollo di amplificazione per frammenti di 210-250 bp messo a punto da noi stessi, utilizzando primers specifici per le sequenze dei 10 esoni codificanti del gene mvk. I prodotti di amplificazione sono stati analizzati mediante DHPLC utilizzando il sistema Wave® Fragment Analysis (Transgenomic, Omaha, NE, USA). Le temperature di melting (Tm) sono state calcolate con Navigator Software 1.7.0 (Transgenomic). Le sequenze degli stessi frammenti amplificati sono state determinate mediante l’uso di un sequenziatore automatico ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (APPLIED BIOSYSTEMS, USA). RISULTATI: I valori sierici di IgD erano normali (<100 mg/L) in 14/19 pazienti. Nessun campione di controllo presentava alterazioni dei profili DHPLC e delle sequenze. Dodici dei 19 pazienti esaminati presentavano almeno un profilo di DHPLC alterato e i dati sono stati confermati con il sequenziamento. Sono state evidenziate le mutazioni S52N (paziente 2-13-15), D170D e c.632-18A>G (paziente 4-5-6-10-12-17-19), S135S (pz 13-16) c.78+61A>G (pz 6-11-19), c.885+24G>A (pz 6-19) già descritte in letteratura e nel database INFEVERS (http://fmf.igh.cnrs.fr/infevers). Lo screening con DHPLC ha permesso di ottenere i risultati in minor tempo (10 ore / paziente) e con costi inferiori (40 euro / paziente) rispetto alla tecnica di sequenziamento diretto (tempo: 25 ore / paziente , costi: 150 euro / paziente). CONCLUSIONI: Un elevato livello sierico di IgD non rappresenta più un marker per fare diagnosi di MKD, come già riportato in letteratura. La DHPLC è una tecnica capace di effettuare uno screening rapido e a basso costo nell’analisi di mutazioni in pazienti con sospetta sindrome autoinfiammatoria legata al gene mvk. Tuttavia, essendo una tecnica di analisi indiretta, è necessario considerare che la DHPLC aumenta l’efficienza dell’analisi ma non la sua sensibilità in quanto è in grado di evidenziare un polimorfismo di sequenza ma non la sua posizione. Sette pazienti della nostra coorte sono risultati portatori delle varianti alleliche D170D e c.632-18A>G; tale evento suggerisce che questi SNP potrebbero essere in linkage disequilibrium e che tali mutazioni potrebbero indurre una diminuzione nell’attività della MK predisponendo quindi alla MKD.