Non-systemic metamorphosis: millipede gonopods as a model system

Arthropod post-embryonic life is characterized by periodical moult cycles. These events are essential during individual growth, given that a rigid exoskeleton wraps them. When a moult event corresponds with a relatively sudden and conspicuous change in animal’s structure, is called metamorphosis; this phenomenon is characterized by a relatively high level of processes like apoptosis and cellular proliferation. For this reason, the study of the processes involved during metamorphosis has become a very important subject in evolutionary developmental biology (evo-devo) of arthropods. The principal limit of these researches, nevertheless, is that they focus on a small number of species and to draw general conclusions based uniquely on data collected from a few model systems can be risky. Recent studies about metamorphosis underpin on species characterized in most of the cases by a systemic metamorphosis. These are mainly holometabolous insects, in which the transition to the adult is rich of changes, affecting the whole body, although often with different degrees of intensity. Most of the arthropods, exhibits minor post-embryonic changes. Less usual is a situation in which a sudden developmental change affects one or a few non terminal segments, that initially are identical to those that precede and follow them along the body. This kind of post-embryonic transformation, confined in a well defined region of the body, is defined in this thesis with the term non-systemic metamorphosis. It can be observed during the post-embryonic development of males of helminthomoph millipedes. In males helminthomorph millipedes, during post-embryonic life, a sudden changes occurs that involves only one or two pair of non terminal appendages, initially not different from the others and part of a long homonomous series. In the adults these appendages, localized in the seventh ring, are modified into gonopods, that are used as claspers or to transfer sperm during the copula. During the first stages of development the seventh ring is identical to the others and it brings two pair of conventional walking legs; in one of the following stage the legs are substituted by extremely reduced structures (called squamiform appendages), that subsequently turn into gonopods. In this thesis I investigated the metamorphosis of the eighth and ninth pair of legs, that correspond to the seventh ring of the body (a ring is a morphological unit that generally is considered as two conventional segments) in two blanulids (Nopoiulus kochii (Gervais, 1847) and Blaniulus guttulatus (Bosc, 1792)), in one nemasomatid (Nemasoma varicorne C.L. Koch, 1847) and in one polydesmid (Oxidus gracilis (C.L. Koch, 1847)) millipedes. Special attention was paid to the last stage in which males maintain the eighth (and eventually the ninth) pair of locomotory appendages, the stages in which these are substituted by squamiform appendages and the first stage with gonopods. I performed investigations on the external morphology, using optical and scanning electron microscopy. Internal anatomy was described through paraffin sections. The endoskeletal structures associated with gonopods, was studied using confocal laser scanning microscopy taking advantage of the autofluorescence of the cuticle. As documented here for the first time the external modifications caused by the non-systemic metamorphosis of diplopods are associated with a huge rearrangement of internal anatomy. The degree of intensity of internal changes is different in the four species. In the two blaniulids, the consequences that gonopods have in the general trunk architecture are bigger than in the others, in particular because of the voluminous endoskeletal structures. In N. varicorne and in O. gracilis the anatomy of the trunk is less affected. In O. gracilis it was also possible to perform some observations during the last moulting period: it is during this step that squamiform appendages become gonopods undergoing larger modifications. I also present an hypothesis on the basic mechanisms that characterize gonopod formation in millipedes, according to which the changes in the seventh ring depend from the presence of a segmental marker produced during embryonic development, that is activated only much later, at the beginnig of non-systemic metamorphosis.

Di norma gli artropodi, nella loro vita postembrionale, affrontano periodicamente cicli di muta per potersi accrescere, essendo dotati di un esoscheletro rigido che racchiude il corpo dell’animale. Quando la muta coinvolge improvvisi e vistosi cambiamenti nella struttura dell’animale si parla di metamorfosi, un fenomeno caratterizzato da numerosi eventi di apoptosi e proliferazione cellulare. Proprio per questa ragione, lo studio dei processi coinvolti nella metamorfosi è diventato un tema ricorrente ed importante per la biologia evoluzionistica dello sviluppo (evo-devo) degli artropodi. Il principale limite di queste ricerche, tuttavia, riguarda il fatto che sono limitate ad un ristretto numero di specie e trarre conclusioni generali basandosi unicamente sui dati raccolti da pochi sistemi modello può rivelarsi rischioso. Gli studi più recenti sulla metamorfosi sono stati svolti su specie caratterizzate per la maggior parte da una metamorfosi di tipo sistemico. Si tratta principalmente di insetti olometaboli, nei quali il passaggio allo stadio adulto è costellato da cambiamenti che coinvolgono tutto il corpo dell’animale, eventualmente con gradi di intensità diversi. Tuttavia nella maggior parte degli altri artropodi i cambiamenti postembrionali sono notevolmente meno estesi, come avviene, ad esempio, negli insetti emimetaboli. Una situazione sicuramente meno frequente è quella in cui ad essere investite da un brusco cambiamento nello sviluppo siano uno o pochi segmenti non terminali, inizialmente uguali ai moduli che li precedono e che li seguono lungo l’asse principale del corpo. Questo tipo di trasformazione postembrionale, confinata in un distretto del corpo ben circoscritto, è definita, in questa tesi, metamorfosi non sistemica e si può trovare nello sviluppo postembrionale dei maschi dei millepiedi elmintomorfi. Nei maschi dei millepiedi elmintomorfi, durante il processo di crescita postembrionale, avviene un brusco cambiamento che coinvolge solo uno o due paia di appendici non terminali, inizialmente non diverse da tutte quelle che le precedono e le seguono, nel mezzo di una lunga serie omonoma. Negli adulti, infatti, queste appendici, localizzate nel settimo anello del tronco, sono modificate in gonopodi, i quali sono usati come organi di presa o veicoli per il trasferimento dello sperma durante la copula. Osservando nel dettaglio lo sviluppo del settimo anello possiamo notare che: durante i primi stadi di sviluppo è identico agli altri e porta due paia di zampe convenzionali; in un qualche stadio successivo le zampe vengono sostituite da strutture estremamente ridotte (appendici squamiformi) che, successivamente, diverranno gonopodi. Lo scopo di questa tesi è quello di indagare la metamorfosi dell’ottavo e del nono paio di zampe, corrispondenti al settimo anello del tronco (unità morfologica generalmente equivalente a due segmenti convenzionali) dei seguenti diplopodi: due blaniulidi Nopoiulus kochii (Gervais, 1847) e Blaniulus guttulatus (Bosc, 1792), uno julide nemasomatide Nemasoma varicorne C.L. Koch, 1847 ed un polidesmide Oxidus gracilis (C.L. Koch, 1847). In particolare, ho analizzato l’ultimo stadio in cui i maschi presentano l’ottavo (ed eventualmente il nono) paio di appendici locomotorie, gli stadi in cui queste sono sostituite da appendici squamiformi e il primo stadio che presenta i gonopodi. Gli studi effettuati hanno previsto principalmente indagini di morfologia esterna, basate sulla microscopia ottica e sulla microscopia elettronica a scansione, mentre l’anatomia interna è stata descritta principalmente attraverso l’utilizzo di protocolli istologici. Le strutture endoscheletriche associate ai gonopodi sono state studiate attraverso l’uso del microscopio confocale a scansione laser, sfruttando l’autofluorescenza della cuticola. Dai risultati ottenuti emerge che le modificazioni esterne dovute alla metamorfosi non sistemica nei diplopodi sono associate a un notevole riarrangiamento dell’anatomia interna, documentato per la prima volta con questa tesi. Il grado di intensità dei cambiamenti interni è diverso nelle quattro specie: i due blaniulidi risentono maggiormente dell’impatto che i gonopodi hanno nell’architettura generale del tronco, in particolare a causa delle voluminose strutture endoscheletriche. Al contrario in N. varicorne, ed in particolare in O. gracilis, l’anatomia del tronco viene modificata in modo meno significativo. Nel polidesmide è stato anche possibile effettuare alcune osservazioni durante l’ultimo periodo di muta, durante il quale avvengono le maggiori modificazioni trasformando le appendici squamiformi in gonopodi. Viene inoltre presentata un’ipotesi sui meccanismi di base che caratterizzano la formazione dei gonopodi nei millepiedi, secondo la quale i cambiamenti del settimo anello dipendono dalla presenza di un marcatore segmentale prodotto durante lo sviluppo embrionale, che viene attivato solo molto più tardi, quando iniziano i cambiamenti dovuti alla metamorfosi non sistemica.