Activity-dependent and -independent control of circadian rhythms in mammalian skeletal muscle

Autonomous biological rhythms allow organisms to coordinate internal processes with environmental conditions. Mammals exhibit a diverse array of both behavioral and physiological rhythms that are generated by an endogenous molecular timing system composed of a central pacemaker within the suprachiasmatic nucleus (SCN) of the hypothalamus in addition to autonomous oscillators within the cells of peripheral tissues. Previous reports have shown that clock-controlled outputs are essential for the temporally coordinated execution of many tissue-specific functions, yet specific entrainment pathways for skeletal muscle, a peripheral tissue that accounts for the majority of daily energy consumption, remain largely speculative. Studies suggest that both neural and humoral factors contribute to phase-coordinate the expression of rhythmic genes in peripheral tissues, and locomotor activity, autonomic innervation and metabolic signals resulting from food availability are all probable mediators of rhythmic gene expression in skeletal muscle. Here we investigated entrainment of the skeletal muscle core oscillator by selectively manipulating each proposed pathway in vivo while monitoring expression profiles of the core clock genes Bmal1, Per1 and Per2. Monitoring circadian nucleocytoplasmic shuttling and transcriptional activity of the nerve activity-dependent sensor NFAT, we demonstrate that while some rhythmically expressed genes are strictly activity-dependent, motor innervation is not an important factor regulating phase entrainment of the core oscillator. Similarly, a chemical sympathectomy with 6-OHDA failed to significantly alter the phase of the core clock genes. However, two weeks of a restricted feeding schedule significantly shifted the phase of Bmal1 expression in skeletal muscle as in liver, while, surprisingly, both Per1 and Per2 expression lost rhythmicity. These results clearly show that the circadian transcriptome in skeletal muscle is composed of both activity-dependent and –independent genes, and furthermore, that entrainment of the skeletal muscle circadian oscillator depends on metabolic factors rather than on neural activity.

I ritmi biologici autonomi permettono agli organismi di coordinare i processi interni con le condizioni ambientali. I mammiferi mostrano diversi tipi di ritmi comportamentali e fisiologici, che sono generati da un orologio molecolare endogeno composto da un “pacemaker” centrale presente all'interno del nucleo soprachiasmatico (SCN) dell'ipotalamo e degli oscillatori autonomi all'interno delle cellule dei tessuti periferici. Studi precedenti hanno indicato che i segnali generati da questo sono essenziali per la coordinazione temporale di molte funzioni tessuto-specifiche. Tuttavia, rimane in gran parte speculativo quale sia ruolo specifico di questo sistema nel muscolo scheletrico, un tessuto periferico in cui avviene la maggior parte del consumo di energia quotidiano. Alcuni studi suggeriscono che sia i fattori neuronali che quelli umorali contribuiscono all'espressione dei geni ritmici nei tessuti periferici e dall'attività locomotoria e che l’innervazione autonoma ed i segnali metabolici regolati dalla disponibilità di cibo sono i probabili mediatori dell'espressione di geni ritmici nel muscolo scheletrico. In questo lavoro di tesi abbiamo studiato il ruolo dell’orologio biologico nel muscolo scheletrico, analizzando selettivamente ogni via di segnale proposta “in vivo” e controllando i profili di espressione dei geni dell'orologio Bmal1, Per1 e Per2. L’osservazione della traslocazione circadiana nucleo-citoplasma e l’attività trascrizionale del fattore NFAT, un sensore dell’attività nervo-dipendente, ci ha permesso di dimostrare che l’espressione dei geni dell’orologio e’ direttamente correlato con l’attività e che l’innervazione non e’ essenziale nella regolazione dell’orologio biologico. Similmente, l’uso di un composto chimico (6-hydroxydopamine) non ci ha permesso di alterare significativamente la fase dei geni dell'orologio. Tuttavia, sottoponendo gli animali a due settimane di programma d'alimentazione limitato abbiamo osservato un significativo spostamento di fase dell’espressione Bmal1 nel muscolo scheletrico e nel fegato, mentre, l’espressione sia di Per1 che di Per2 ha perso la fase di ritmo. Questi risultati indicano chiaramente che la transcritoma circadiano nel muscolo scheletrico comprende sia geni attività-dipendente che indipendente e, che l’oscillazioni dell’orologio circadiano nel muscolo scheletrico dipendono dai fattori metabolici e non dall’attività neuronale.