Analisi di parametri della proliferazione e del differenziamento cellulare in due modelli post-infiammatori: Metaplasia di Barrett e Rigenerazione muscolare.

CHAPTER A: CENTROSOMAL ABERRATION ANALYSIS IN A SURGICAL ESOPHAGITIS AND ESOPHAGEAL ADENOCARCINOMA ANIMAL MODEL AND IN VITRO MODEL The centrosom is the MTOC (microtubule organizing center) and is the main centre of microtubules organization. Centrosomal aberrations (CeAb), numerical and structural, have been identified in various diseases, but are mainly found in an increasing number of cancers. The CeAbs identified in various types of cancer have been identified as a potential cause of the loss of cell and tissue and as a possible source of instability (nucleation and disruption in the organization of microtubules, incorrect segregation of chromosomes resulting in aneuploidy). More recently, CeAb were found in different carcinomas in situ, making assume that these changes are also involved in tumorigenesis. My work is part of a project that involved the search for aberrations in centrosomali samples bioptici human esophageal adenocarcinoma arising on Barrett's metaplasia. Through this study it was demonstrated the presence of aberrations centrosomali in about 80% of patients and that such aberrations were very prominent and extended throughout the fabric metaplastico in 50% of cases. In light of these results were developed two experimental models, an animal model of Barrett's esophagus and a crop of primary esophageal epithelial cells. The goal was to use both models for the analysis of aberrations centrosomali so you can follow the evolution in time along the tumor progression in first and second after the treatment with two bile salts. CHAPTER B: USE OF MURINE MACROPHAGE CONDITIONED MEDIUM TO SELECT A MULTIPOTENT CELLS SUBPOPULATION AND ITS EFFECTS ON THEIR DIFFERENTIAL AND MUSCLE REGENERATION. The inflammatory processes caused by injury, disease or strenuous exercise play a key role during muscle regeneration. Many of the signals issued during these processes are exchanged between macrophages and muscle precursors, but their role is still unknown. Skeletal muscle regeneration relies onto satellite cells, a population of muscle precursors. Inflammation also plays a determinant role in the process, as upon injuring macrophages are attracted by the damaged myofibers and the activated satellite cells and act as key elements of dynamic muscle supportive stroma. Yet, it is not kwon how macrophages interact with the more profound stem cells of the satellite cell niche. This work showed that in the presence of a murine macrophage conditioned medium (mMCM) a subpopulation of stem-like cells could be selected and expanded from adult rat muscle. These cells were small, round, poorly adhesive, slow-growing and showed mesenchimal differentiation plasticity. Experiments with satellite cells mechanically isolated from suspensions of single myofibers also showed that mMCM inhibited their mesenchimal potential towards adipogenesis. In vivo, intramuscolar administrations of concentrated mMCM in a rat model of extensive surgical ablation dramatically improved muscle regeneration. Altogether, these findings suggest that macrophagic factors could be of great help in developing therapeutic protocols with myogenic stem cells.

Capitolo A Il centrosoma è anche detto MTOC (microtubule organizing center), in quanto è il principale centro di organizzazione dei microtubuli. Aberrazioni centrosomali (CeAb), numeriche e strutturali, sono state individuate in diverse patologie, ma soprattutto sono riscontrate in un numero sempre maggiore di tumori. Le CeAb individuate nei diversi tipi di tumore sono state indicate come potenziale causa della perdita dell’architettura cellulare e tissutale e come possibile fonte di instabilità genetica (disfunzione nella nucleazione e organizzazione dei microtubuli, errata segregazione dei cromosomi con conseguente aneuploidia). Più recentemente, CeAb sono state riscontrate in diversi carcinomi in situ, facendo ipotizzare che tali alterazioni siano coinvolte anche nella tumorigenesi. Il mio lavoro si inserisce in un progetto che prevedeva la ricerca di aberrazioni centrosomali in campioni bioptici umani di adenocarcinoma esofageo insorto su metaplasia di Barrett. Mediante questo studio è stato possibile dimostrare la presenza di aberrazioni centrosomali in circa l’80% dei pazienti e che tali aberrazioni sono risultate molto prominenti ed estese in tutto il tessuto metaplastico nel 50% dei casi. Alla luce di questi risultati, quindi, sono stati messi a punto due modelli sperimentali, un modello animale di Esofago di Barrett e uno di colture primarie di cellule epiteliali esofagee. L’obiettivo è stato quello di utilizzare entrambi i modelli per le analisi di aberrazioni centrosomali in modo da poterne seguirne temporalmente l’evoluzione lungo la progressione tumorale nel primo caso e nel secondo da verificare se in seguito al trattamento con due Sali biliari nelle cellule epiteliali si generano aberrazioni centrosomali, in particolare rappresentate da aggregati di tubulina. CAPITOLO B: CAPACITA’ DEL MEDIUM CONDIZIONATO DA MACROFAGI MURINI DI SELEZIONARE UNA SOTTOPOPOLAZIONE DI CELLULE MULTIPOTENTI E SUOI EFFETTI SUL LORO DIFFERENZIAMENTO E SULLA RIGENERAZIONE MUSCOLARE. I processi infiammatori dovuti ad un trauma o ad una malattia muscolare o ad un importante sforzo fisico giocano un ruolo chiave nella rigenerazione muscolare. Molti dei segnali rilasciati durante questi processi vengono scambiati tra macrofagi e precursori miogenici, ma il loro ruolo è ancora poco conosciuto. La rigenerazione del muscolo scheletrico dipende dalle cellule satelliti, una popolazione di precursori miogenici. L’infiammazione gioca un ruolo determinante in questo processo, in seguito al danno i macrofagi sono attratti dalle miofibre danneggiate e la cellule satelliti vengano attivate. Non è ancora noto come i macrofagi interagiscano con le cellule staminali più profonde localizzate nelle nicchie delle cellule satellite. In questo lavoro è stato visto che in presenza di un medium condizionato da macrofagi murini (mMCM) una sottopopolazione di cellule multipotenti stem-like potrebbe essere selezionata ed espansa da muscolo di ratto adulto. Queste cellule sono piccole, rotonde, poco adesive, crescono lentamente e mostrano una plasticità di differenziamento mesenchimale. Esperimenti con cellule satelliti, isolate meccanicamente da sospensione di singole miofibre hanno mostrato che l’mMCM inibisce il loro potenziale mesenchimale verso l’adipogenesi. In vivo la somministrazione di mMCM concentrato in un modello di ratto in cui è stata praticata un’estesa ablazione chirurgica migliora enormemente la rigenerazione muscolare. Tutti questi risultati suggeriscono che i fattori macrofagici potrebbero essere di grande aiuto nello sviluppare protocolli terapeutici con cellule staminali miogeniche.