Human mesenchymal stromal cells (hMSCs) are multipotent cells isolated from several tissues that possess self-renewal capacity, long term viability and are capable to differentiate into several cell lineages (osteoblasts, chondrocytes, adipocytes, etc.). They interact with hematopoietic stem cells (HSC) and exert immunoregulatory function. These characteristics make MSCs excellent candidates for regenerative medicine and gene therapy. To date, bone marrow (BM) has been the main source for the isolation of hMSCs,but in the last decade some drawbacks arose: 1) the cells low number that requires an ex vivo expansion; 2) the BM MSCs senescence with increasing of donor age; 3) the invasive procedure. This has led many researchers to investigate alternative MSCs sources and new expansion protocols to bypass FBS/human platelet rich plasma (hPRP) limitations: 1) the risk of prion diseases and immunological reactions associated with the use of FBS; 2) the decreased proliferative effect of hPRP after high g rate centrifugation to purify it, its undefined composition and its full clinical impact that remains to be investigated. In addition, its use is limited by the amount of whole blood necessary to obtain a sufficient quantity of autologous hPRP for cell expansion. In this study we focused on: 1) adipose tissue derived-MSCs (AT MSCs) because of the high number of cells that can be obtained and the easy enzyme-based procedures; 2) umbilical cord derived-MSCs (UC MSCs) which possess greater and faster expansion capability, higher frequency of colony forming unit fibroblast (CFU-F) than BM MSCs. For the first time, we evaluated, measuring bromo-deoxyuridine incorporation in neosynthesized DNA, the effects on AT and UC MSCs expansion of a pool of seven human recombinant growth factors: epidermal growth factor (EGF), basic-fibroblast growth factor (bFGF), granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), hepatocyte growth factor (HGF), insulin-like growth factor I (IGF I), platelet-derived Growth factor-bb (PDGFbb) and transforming growth factor β1 (TGFβ1). We defined two cytokines cocktails based on EGF-bFGF-PDGFbb for AT MSCs, and EGF-PDGFbb for UC MSCs expansion in a FBS-free medium supplemented with hPPP (3%), which allows a normal MSCs expansion with a minimal apoptosis and supports GFs proliferative effect. These mixtures permitted us, starting from about 100-150 cm3 of AT and 30 cm of UC, to obtain after 21 days of culture a sufficient number of cells for clinical applications, for example in graft versus host disease (GvHD). Furthermore, in our expansion conditions, we required about 80 ml of hPPP obtainable from 150-200 ml of whole blood, as opposed to 350 ml of hPRP which requires 1000-1200 ml of whole blood. The mitogenic response decreases when MEK signaling is inhibited by U0126, a MEK1/2 inhibitor. This result suggests that MEK 1/2 pathway is required to mediate a maximum mitogenic response of cells to GFs. Our cocktails do not influence surface markers expression. AT and UC MSCs highly expressed CD 105, CD 90, and CD 44, whereas cells expressing CD 31, CD 34, CD 117 and CD 45 were lost with progressive passages, in line with the parameters proposed for MSCs by International Society for Cellular Therapy. High levels of the enzyme aldehyde dehydrogenase (ALDH) have proven to be a novel marker for the identification and isolation of hematopoietic stem cells (HSCs). Co-staining experiments revealed that >80% of ALDH+ umbilical cord blood cells were CD 34+. Based on our studies, ALDH combined with other surface markers (CD 45 and CD 105) can not be used exclusively to define MSCs derived from AT and UC in a manner similar to HSCs because of its low level (less than 50%). Differentiation capacity into adipogenic and osteogenic lineage, tested at the end of P2, was confirmed only for AT MSCs. The exposure to EGF-bFGF-PDGFbb increased adipogenic differentiation as well as osteogenic one respect to cultures in FBS and hPPP, likely because these GFs commit MSCs to specific mesodermal differentiation. This could represent a highly promising approach in tissue engineering for breast soft tissue reconstruction after mastectomy, tissue and subdermal defects after trauma or burn injury. AT MSCs were reported to have a slightly inferior potential for osteogenesis, with our GFs cocktail this “problem” could be overcome, a normal osteogenesis could take place and it could guarantee a large amount of osteogenic precursors for scaffold population. UC MSCs, probably due to their ontogenetic age, did not show mineralization and the formation of lipid vacuoles, but they were more immunocompetent than AT ones in the presence of GFs. UC MSCs immunosuppressive effect, on T cells stimulated with phytohemagglutinin, was confirmed in all tested supplements and was significant when MSCs:T cell ratio was 1:10. AT MSCs immunomodulation was detectable at 1:5 ratio in the presence of GFs cocktail and it was less marked than in FBS, likely because GFs, inducing cell maturation, reduce immunomodulatory potential. Whereas, UC MSCs, having relatively primitive nature, seem to be less influenced by cytokines than mature MSCs. We did not measure a significant immunosuppression when AT/UC MSCs and lymphocytes were separated by transwell. This suggests that the suppressive factor(s) are not constitutively secreted by MSCs and probably a pre-activation mediated by cell contact is required. Recently, a number of clinical trials used cytokine induced killer (CIK) cells in an attempt to improve the effectiveness of HSC transplantation. CIK cells are a population of immune-effector cells CD 3+ CD 56+, expanded in vitro by exposure to interferon γ, monoclonal anti CD3 and interleukin 2. They show cytotoxicity against a broad range of malignant cell targets, but not against normal CD 34+ stem cells. In view of relevant role of both MSCs and CIK cells, we explored the interactions between the two cell types. We found that CIK cells lysed UC MSCs in dose dependent manner, while UC cells killed CIK ones and suppressed their cytotoxicity against K562, a tumour target. These effects required cell to cell contact. Our results should be taken into account in evaluating novel protocols of adoptive immunotherapy. They suggest to administer, at first, mesenchymal cells to optimize engraftment and to prevent GvHD, and then CIK cells to mediate graft versus leukemia. In conclusion, our cocktails guarantee the expansion of an extremely homogeneous population of MSCs and a sufficient number of cells for clinical applications: committed AT MSCs in reconstructive medicine, and UC MSCs in hematologic context in combination with CIK cells.

Le cellule stromali mesenchimali umane (hMSC) sono cellule multipotenti, isolate da numerosi tessuti, con capacità di autoreplicarsi e di differenziarsi in più linee cellulari (osteoblasti, condrociti, adipociti, ecc.). Interagiscono con le cellule staminali ematopoietiche (HSC) e hanno proprietà immunomodulanti. Queste caratteristiche hanno reso le MSC eccellenti candidate per la medicina rigenerativa e la terapia genica. Fino ad oggi il midollo osseo (BM) ha rappresentato la fonte principale di MSC, ma nell’ultimo decennio sono state sollevate delle riserve: 1) la bassa frequenza che richiede un’espansione ex vivo; 2) la comparsa di senescenza con il progredire dell’età del donatore; 3) la procedura di prelievo invasiva. Questo ha spinto i ricercatori ad investigare, da una parte, fonti alternative e, dall’altra, nuovi protocolli di espansione per bypassare gli inconvenienti associati all’uso del siero fetale bovino (FBS) e di plasma umano arricchito di piastrine (hPRP). Le principali limitazioni sono legate, per l’FBS, al rischio di trasmissione di malattie prioniche e di reazioni immunitarie causate dalle proteine xenogeniche; per hPRP, alla sua composizione variabile, ad un effetto clinico poco conosciuto e, soprattutto, all’alta quantità di sangue intero richiesto per ottenere un volume di hPRP autologo sufficiente per l’espansione ex vivo delle MSC. In più, la centrifugazione ad alte g, nel tentativo di rimuovere le membrane delle piastrine, decresce l’effetto proliferativo di hPRP. In questo studio sono state prese in esame due fonti alternative: 1) il tessuto adiposo (AT), da dove le MSC sono ottenibili in alto numero e con una facile procedura enzimatica; 2) il cordone ombelicale (UC), dal quale sono isolabili, come riportato in letteratura, MSC caratterizzate da frequenza e capacità replicativa maggiori rispetto alle BM MSC. Per la prima volta è stato valutato, misurando l’incorporazione della bromo-deossiuridina nel DNA neosintetizzato, l’effetto sulla proliferazione di AT e UC MSC di un pool di sette fattori di crescita (GF) umani ricombinanti: epidermal growth factor (EGF), basic-fibroblast growth factor (bFGF), granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), hepatocyte growth factor (HGF), insulin-like growth factor I (IGF I), platelet-derived growth factor-bb (PDGFbb) e transforming growth factor β1 (TGFβ1). Sono stati così definiti due cocktail a base di EGF-bFG-PDGFbb per le AT MSC e EGF-PDGFbb per espansione delle UC MSC in un mezzo FBS-free supplementato con plasma umano povero di piastrina (hPPP, 3%), che supporta la crescita delle mesenchimali minimizzando l’apoptosi e consente l’azione dei GF. Queste combinazioni di citochine sono state in grado di fornire, dopo 21 giorni di coltura, un numero sufficiente di cellule per un eventuale trattamento, ad esempio, della graft versus host disease (GvHD), partendo da 100-150 cm3 di AT e 20-30 cm di UC. Inoltre, nelle condizioni di coltura definite, sono serviti circa 80 ml di hPPP ottenibili da 150-200 ml di sangue intero, invece dei 350 ml di hPRP ricavabili da 1000-1200 ml di sangue. La risposta mitogenica riscontrata sembra coinvolgere due protein-kinasi specifiche, MEK1 e MEK2, come evidenziato in presenza di un loro inibitore specifico (U0126). Questo suggerisce la priorità di questa via nel mediare la risposta mitogenica massima delle citochine. I cocktail, inoltre, non influenzano l’espressione dei marker di superficie caratteristici delle mesenchimali. CD 105, CD 90 e CD 44 sono risultati altamente espressi sia sulle AT che sulle UC MSC, mentre la percentuale di cellule positive al CD 31, CD 34, CD 117 e CD 45 decresceva con il progredire dei passaggi, in linea con i criteri definiti dall’International Society for Cellular Therapy. Le aldeidi deidrogenasi (ALDH), una classe di enzimi ossidativi, sono state di recente proposte come marker per l’identificazione e l’isolamento delle HSC dove sono espresse ad alti livelli (>80% nelle cellule CD 34+ isolate dal sangue della vena del cordone ombelicale). In questo studio si è indagato se le ALDH potessero svolgere un ruolo analogo per le MSC. I risultati ottenuti hanno evidenziato che le ALDH, combinate con CD 45 e CD 105, non possono essere usate come marker identificativi per le MSC derivate da AT e UC a causa della loro bassa espressione (inferiore al 50%). La capacità differenziativa in senso adipogenico ed osteogenico, testato a fine del secondo passaggio (P2), è stata confermata per la AT MSC. L’esposizione a EGF-bFGF-PDGFbb ha incrementato l’adipogenesi e l’osteogenesi rispetto alla coltura in FBS e hPPP, probabilmente le citochine stimolano l’attivazione dei pathway coinvolti nel differenziamento adipogenico ed osteogenico. L’utilizzo di cellule mesenchimali “indirizzate” al differenziamento adipogenico potrebbe rappresentare una promettente risorsa in chirurgia plastica e ricostruttiva per la ricostruzione del seno dopo mastectomia, per la riparazione di difetti tissutali e subdemici conseguenti a traumi o ustioni. Per le AT MSC è stata riferita una potenzialità osteogenica inferiore alle altre MSC adulte. Con il cocktail definito, che predispone le AT MSC anche all’osteogenesi, questo “problema” potrebbe essere superato, garantendo un numero sufficiente di precursori osteogenici per il popolamento di uno scaffold. Le UC MSC, forse a causa della loro età ontogenia, non hanno evidenziato mineralizzazione e la formazione di vacuoli lipidici, ma si sono dimostrate più immunocompetenti delle AT MSC in presenza dei GF. L’effetto immunomodulante, a carico dei linfociti T attivati con fitoemagglutinina, è stato registrato per le UC MSC ad un rapporto MSC: cellule T pari a 1:10 in tutte le condizioni testate. L’immunomodulazione indotta dalle AT MSC è stata invece riscontrata a 1:5 in presenza del cocktail risultando così più blanda di quella in FBS. Probabilmente i fattori di crescita, inducendo la maturazione e predisponendo le cellule al differenziamento, compromettono le potenzialità immunomodulanti delle mesenchimali isolate da AT. Le UC MSC, essendo invece più immature, sono forse meno suscettibili all’azione dei GF rispetto alle MSC adulte. Quando tra mesenchimali e linfociti si è interposta una “barriera” che ne impediva il contatto “fisico”, non è stato rilevato alcun blocco significativo della proliferazione delle cellule T. Si può concludere che il contatto cellulare rappresenti la condizione necessaria per attivare i meccanismi di immunosoppressione come la produzione di fattori solubili. Recentemente, si sono moltiplicati i trial clinici dove si vanno ad infondere cellule CIK (cytokine induced killer) con lo scopo di aumentare l’efficienza del trapianto di HSC. Le cellule CIK sono una popolazione linfocitaria CD 3+ CD 56+, espanse in vitro con interferone γ, anti CD3 e interleuchina 2, e dotate di azione citotossica verso numerosi target tumorali, ma non sulle staminali CD 34+. Visto il ruolo rilevante in campo ematologico sia delle MSC che delle CIK, è stata indagata l’interazione tra le due popolazioni cellulari. Le CIK hanno mostrato un’azione citotossica sulle UC MSC dose dipendente, mentre le mesenchimali hanno determinato la soppressione delle CIK e la riduzione della loro potenzialità citotossica a carico della K562, un target tumorale. Questi risultati dovrebbero essere tenuti presenti nella definizione di nuovi protocolli clinici di immunoterapia. Essi suggeriscono di somministrare prima le mesenchimali al fine di supportare l’attecchimento delle HSC e prevenire la GvHD, e solo in un secondo tempo le CIK ad azione antitumorale. In conclusione, i cocktail definiti garantiscono l’espansione di una popolazione omogenea di mesenchimali e in numero sufficiente per l’uso clinico delle AT MSC “committed” in medicina ricostruttiva, e delle UC MSC in un contesto ematologico in combinazione con le cellule CIK a patto di una somministrazione in due tempi.

Definizione di cocktail citochinici per l'espansione, in condizioni FBS-free, di cellule stromali mesenchimali isolate da tessuto adiposo e cordone ombelicale / Chieregato, Katia. - (2010).

Definizione di cocktail citochinici per l'espansione, in condizioni FBS-free, di cellule stromali mesenchimali isolate da tessuto adiposo e cordone ombelicale

Chieregato, Katia
2010

Abstract

Le cellule stromali mesenchimali umane (hMSC) sono cellule multipotenti, isolate da numerosi tessuti, con capacità di autoreplicarsi e di differenziarsi in più linee cellulari (osteoblasti, condrociti, adipociti, ecc.). Interagiscono con le cellule staminali ematopoietiche (HSC) e hanno proprietà immunomodulanti. Queste caratteristiche hanno reso le MSC eccellenti candidate per la medicina rigenerativa e la terapia genica. Fino ad oggi il midollo osseo (BM) ha rappresentato la fonte principale di MSC, ma nell’ultimo decennio sono state sollevate delle riserve: 1) la bassa frequenza che richiede un’espansione ex vivo; 2) la comparsa di senescenza con il progredire dell’età del donatore; 3) la procedura di prelievo invasiva. Questo ha spinto i ricercatori ad investigare, da una parte, fonti alternative e, dall’altra, nuovi protocolli di espansione per bypassare gli inconvenienti associati all’uso del siero fetale bovino (FBS) e di plasma umano arricchito di piastrine (hPRP). Le principali limitazioni sono legate, per l’FBS, al rischio di trasmissione di malattie prioniche e di reazioni immunitarie causate dalle proteine xenogeniche; per hPRP, alla sua composizione variabile, ad un effetto clinico poco conosciuto e, soprattutto, all’alta quantità di sangue intero richiesto per ottenere un volume di hPRP autologo sufficiente per l’espansione ex vivo delle MSC. In più, la centrifugazione ad alte g, nel tentativo di rimuovere le membrane delle piastrine, decresce l’effetto proliferativo di hPRP. In questo studio sono state prese in esame due fonti alternative: 1) il tessuto adiposo (AT), da dove le MSC sono ottenibili in alto numero e con una facile procedura enzimatica; 2) il cordone ombelicale (UC), dal quale sono isolabili, come riportato in letteratura, MSC caratterizzate da frequenza e capacità replicativa maggiori rispetto alle BM MSC. Per la prima volta è stato valutato, misurando l’incorporazione della bromo-deossiuridina nel DNA neosintetizzato, l’effetto sulla proliferazione di AT e UC MSC di un pool di sette fattori di crescita (GF) umani ricombinanti: epidermal growth factor (EGF), basic-fibroblast growth factor (bFGF), granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), hepatocyte growth factor (HGF), insulin-like growth factor I (IGF I), platelet-derived growth factor-bb (PDGFbb) e transforming growth factor β1 (TGFβ1). Sono stati così definiti due cocktail a base di EGF-bFG-PDGFbb per le AT MSC e EGF-PDGFbb per espansione delle UC MSC in un mezzo FBS-free supplementato con plasma umano povero di piastrina (hPPP, 3%), che supporta la crescita delle mesenchimali minimizzando l’apoptosi e consente l’azione dei GF. Queste combinazioni di citochine sono state in grado di fornire, dopo 21 giorni di coltura, un numero sufficiente di cellule per un eventuale trattamento, ad esempio, della graft versus host disease (GvHD), partendo da 100-150 cm3 di AT e 20-30 cm di UC. Inoltre, nelle condizioni di coltura definite, sono serviti circa 80 ml di hPPP ottenibili da 150-200 ml di sangue intero, invece dei 350 ml di hPRP ricavabili da 1000-1200 ml di sangue. La risposta mitogenica riscontrata sembra coinvolgere due protein-kinasi specifiche, MEK1 e MEK2, come evidenziato in presenza di un loro inibitore specifico (U0126). Questo suggerisce la priorità di questa via nel mediare la risposta mitogenica massima delle citochine. I cocktail, inoltre, non influenzano l’espressione dei marker di superficie caratteristici delle mesenchimali. CD 105, CD 90 e CD 44 sono risultati altamente espressi sia sulle AT che sulle UC MSC, mentre la percentuale di cellule positive al CD 31, CD 34, CD 117 e CD 45 decresceva con il progredire dei passaggi, in linea con i criteri definiti dall’International Society for Cellular Therapy. Le aldeidi deidrogenasi (ALDH), una classe di enzimi ossidativi, sono state di recente proposte come marker per l’identificazione e l’isolamento delle HSC dove sono espresse ad alti livelli (>80% nelle cellule CD 34+ isolate dal sangue della vena del cordone ombelicale). In questo studio si è indagato se le ALDH potessero svolgere un ruolo analogo per le MSC. I risultati ottenuti hanno evidenziato che le ALDH, combinate con CD 45 e CD 105, non possono essere usate come marker identificativi per le MSC derivate da AT e UC a causa della loro bassa espressione (inferiore al 50%). La capacità differenziativa in senso adipogenico ed osteogenico, testato a fine del secondo passaggio (P2), è stata confermata per la AT MSC. L’esposizione a EGF-bFGF-PDGFbb ha incrementato l’adipogenesi e l’osteogenesi rispetto alla coltura in FBS e hPPP, probabilmente le citochine stimolano l’attivazione dei pathway coinvolti nel differenziamento adipogenico ed osteogenico. L’utilizzo di cellule mesenchimali “indirizzate” al differenziamento adipogenico potrebbe rappresentare una promettente risorsa in chirurgia plastica e ricostruttiva per la ricostruzione del seno dopo mastectomia, per la riparazione di difetti tissutali e subdemici conseguenti a traumi o ustioni. Per le AT MSC è stata riferita una potenzialità osteogenica inferiore alle altre MSC adulte. Con il cocktail definito, che predispone le AT MSC anche all’osteogenesi, questo “problema” potrebbe essere superato, garantendo un numero sufficiente di precursori osteogenici per il popolamento di uno scaffold. Le UC MSC, forse a causa della loro età ontogenia, non hanno evidenziato mineralizzazione e la formazione di vacuoli lipidici, ma si sono dimostrate più immunocompetenti delle AT MSC in presenza dei GF. L’effetto immunomodulante, a carico dei linfociti T attivati con fitoemagglutinina, è stato registrato per le UC MSC ad un rapporto MSC: cellule T pari a 1:10 in tutte le condizioni testate. L’immunomodulazione indotta dalle AT MSC è stata invece riscontrata a 1:5 in presenza del cocktail risultando così più blanda di quella in FBS. Probabilmente i fattori di crescita, inducendo la maturazione e predisponendo le cellule al differenziamento, compromettono le potenzialità immunomodulanti delle mesenchimali isolate da AT. Le UC MSC, essendo invece più immature, sono forse meno suscettibili all’azione dei GF rispetto alle MSC adulte. Quando tra mesenchimali e linfociti si è interposta una “barriera” che ne impediva il contatto “fisico”, non è stato rilevato alcun blocco significativo della proliferazione delle cellule T. Si può concludere che il contatto cellulare rappresenti la condizione necessaria per attivare i meccanismi di immunosoppressione come la produzione di fattori solubili. Recentemente, si sono moltiplicati i trial clinici dove si vanno ad infondere cellule CIK (cytokine induced killer) con lo scopo di aumentare l’efficienza del trapianto di HSC. Le cellule CIK sono una popolazione linfocitaria CD 3+ CD 56+, espanse in vitro con interferone γ, anti CD3 e interleuchina 2, e dotate di azione citotossica verso numerosi target tumorali, ma non sulle staminali CD 34+. Visto il ruolo rilevante in campo ematologico sia delle MSC che delle CIK, è stata indagata l’interazione tra le due popolazioni cellulari. Le CIK hanno mostrato un’azione citotossica sulle UC MSC dose dipendente, mentre le mesenchimali hanno determinato la soppressione delle CIK e la riduzione della loro potenzialità citotossica a carico della K562, un target tumorale. Questi risultati dovrebbero essere tenuti presenti nella definizione di nuovi protocolli clinici di immunoterapia. Essi suggeriscono di somministrare prima le mesenchimali al fine di supportare l’attecchimento delle HSC e prevenire la GvHD, e solo in un secondo tempo le CIK ad azione antitumorale. In conclusione, i cocktail definiti garantiscono l’espansione di una popolazione omogenea di mesenchimali e in numero sufficiente per l’uso clinico delle AT MSC “committed” in medicina ricostruttiva, e delle UC MSC in un contesto ematologico in combinazione con le cellule CIK a patto di una somministrazione in due tempi.
2010
Human mesenchymal stromal cells (hMSCs) are multipotent cells isolated from several tissues that possess self-renewal capacity, long term viability and are capable to differentiate into several cell lineages (osteoblasts, chondrocytes, adipocytes, etc.). They interact with hematopoietic stem cells (HSC) and exert immunoregulatory function. These characteristics make MSCs excellent candidates for regenerative medicine and gene therapy. To date, bone marrow (BM) has been the main source for the isolation of hMSCs,but in the last decade some drawbacks arose: 1) the cells low number that requires an ex vivo expansion; 2) the BM MSCs senescence with increasing of donor age; 3) the invasive procedure. This has led many researchers to investigate alternative MSCs sources and new expansion protocols to bypass FBS/human platelet rich plasma (hPRP) limitations: 1) the risk of prion diseases and immunological reactions associated with the use of FBS; 2) the decreased proliferative effect of hPRP after high g rate centrifugation to purify it, its undefined composition and its full clinical impact that remains to be investigated. In addition, its use is limited by the amount of whole blood necessary to obtain a sufficient quantity of autologous hPRP for cell expansion. In this study we focused on: 1) adipose tissue derived-MSCs (AT MSCs) because of the high number of cells that can be obtained and the easy enzyme-based procedures; 2) umbilical cord derived-MSCs (UC MSCs) which possess greater and faster expansion capability, higher frequency of colony forming unit fibroblast (CFU-F) than BM MSCs. For the first time, we evaluated, measuring bromo-deoxyuridine incorporation in neosynthesized DNA, the effects on AT and UC MSCs expansion of a pool of seven human recombinant growth factors: epidermal growth factor (EGF), basic-fibroblast growth factor (bFGF), granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), hepatocyte growth factor (HGF), insulin-like growth factor I (IGF I), platelet-derived Growth factor-bb (PDGFbb) and transforming growth factor β1 (TGFβ1). We defined two cytokines cocktails based on EGF-bFGF-PDGFbb for AT MSCs, and EGF-PDGFbb for UC MSCs expansion in a FBS-free medium supplemented with hPPP (3%), which allows a normal MSCs expansion with a minimal apoptosis and supports GFs proliferative effect. These mixtures permitted us, starting from about 100-150 cm3 of AT and 30 cm of UC, to obtain after 21 days of culture a sufficient number of cells for clinical applications, for example in graft versus host disease (GvHD). Furthermore, in our expansion conditions, we required about 80 ml of hPPP obtainable from 150-200 ml of whole blood, as opposed to 350 ml of hPRP which requires 1000-1200 ml of whole blood. The mitogenic response decreases when MEK signaling is inhibited by U0126, a MEK1/2 inhibitor. This result suggests that MEK 1/2 pathway is required to mediate a maximum mitogenic response of cells to GFs. Our cocktails do not influence surface markers expression. AT and UC MSCs highly expressed CD 105, CD 90, and CD 44, whereas cells expressing CD 31, CD 34, CD 117 and CD 45 were lost with progressive passages, in line with the parameters proposed for MSCs by International Society for Cellular Therapy. High levels of the enzyme aldehyde dehydrogenase (ALDH) have proven to be a novel marker for the identification and isolation of hematopoietic stem cells (HSCs). Co-staining experiments revealed that >80% of ALDH+ umbilical cord blood cells were CD 34+. Based on our studies, ALDH combined with other surface markers (CD 45 and CD 105) can not be used exclusively to define MSCs derived from AT and UC in a manner similar to HSCs because of its low level (less than 50%). Differentiation capacity into adipogenic and osteogenic lineage, tested at the end of P2, was confirmed only for AT MSCs. The exposure to EGF-bFGF-PDGFbb increased adipogenic differentiation as well as osteogenic one respect to cultures in FBS and hPPP, likely because these GFs commit MSCs to specific mesodermal differentiation. This could represent a highly promising approach in tissue engineering for breast soft tissue reconstruction after mastectomy, tissue and subdermal defects after trauma or burn injury. AT MSCs were reported to have a slightly inferior potential for osteogenesis, with our GFs cocktail this “problem” could be overcome, a normal osteogenesis could take place and it could guarantee a large amount of osteogenic precursors for scaffold population. UC MSCs, probably due to their ontogenetic age, did not show mineralization and the formation of lipid vacuoles, but they were more immunocompetent than AT ones in the presence of GFs. UC MSCs immunosuppressive effect, on T cells stimulated with phytohemagglutinin, was confirmed in all tested supplements and was significant when MSCs:T cell ratio was 1:10. AT MSCs immunomodulation was detectable at 1:5 ratio in the presence of GFs cocktail and it was less marked than in FBS, likely because GFs, inducing cell maturation, reduce immunomodulatory potential. Whereas, UC MSCs, having relatively primitive nature, seem to be less influenced by cytokines than mature MSCs. We did not measure a significant immunosuppression when AT/UC MSCs and lymphocytes were separated by transwell. This suggests that the suppressive factor(s) are not constitutively secreted by MSCs and probably a pre-activation mediated by cell contact is required. Recently, a number of clinical trials used cytokine induced killer (CIK) cells in an attempt to improve the effectiveness of HSC transplantation. CIK cells are a population of immune-effector cells CD 3+ CD 56+, expanded in vitro by exposure to interferon γ, monoclonal anti CD3 and interleukin 2. They show cytotoxicity against a broad range of malignant cell targets, but not against normal CD 34+ stem cells. In view of relevant role of both MSCs and CIK cells, we explored the interactions between the two cell types. We found that CIK cells lysed UC MSCs in dose dependent manner, while UC cells killed CIK ones and suppressed their cytotoxicity against K562, a tumour target. These effects required cell to cell contact. Our results should be taken into account in evaluating novel protocols of adoptive immunotherapy. They suggest to administer, at first, mesenchymal cells to optimize engraftment and to prevent GvHD, and then CIK cells to mediate graft versus leukemia. In conclusion, our cocktails guarantee the expansion of an extremely homogeneous population of MSCs and a sufficient number of cells for clinical applications: committed AT MSCs in reconstructive medicine, and UC MSCs in hematologic context in combination with CIK cells.
growth factors, mesenchymal stromal cell, EGF, bFGF, PDGFbb, umbilical cord, adipose tissue
Definizione di cocktail citochinici per l'espansione, in condizioni FBS-free, di cellule stromali mesenchimali isolate da tessuto adiposo e cordone ombelicale / Chieregato, Katia. - (2010).
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