STUDIO DI TRAFFICKING E POTENZIALE NEUROGENICO DELLA PROTEINA RICOMBINANTE UMANA TAT-OP1

Osteogenic protein-1 (OP-1 or BMP-7) is a multifunctional growth factor of 431 amino acids that belongs to the Bone Morphogenic Protein family (BMPs), a member of the Transforming growth factor β (TGF-β) superfamily. BMPs are synthesized starting from a precursor approximately four times longer than the mature form, and share a C-terminal distinctive pattern ..C…CXGXC…CC…CXCX.. containing seven cysteines active domain. Experimental evidences demonstrated BMPs play a key role not only in cartilage and bone development, but also in non osteogenic tissue formation like the nervous one. Indeed, BMPs are involved during the early development of central nervous system (CNS), and participate as neuroregenerative factors to the neuroregeneration occurring in the adult life. The present study is focused on the hTAT-OP1 protein, a recombinant human fusion protein previously prepared and characterized on preosteoblasts MC3T3E1. hTAT-OP1 is a construct of 162 aminoacids, characterized by the N-terminal end including a 6his-tag sequence followed by the HIV-1-derived TAT sequence as a protein transduction domain, and a peptidase specific cleavage site (spanning 6 AA). The C-terminal end contains the OP-1 domain (126 AA) with the seven cysteines motive, essential for the correct protein folding. Cellular trafficking, biologic activity as neurogenic potential were tested on rat pheocromatocytoma derived PC12 cells, a cell line commonly used for neurogenic in vitro differentiation study. Cell trafficking assays were performed by using western blotting and immunofluorescence. By western blotting, the intracellular presence of hTAT-OP1 as a protein of 18,5 kDa was detected by 6 hours after the treatment with hTAT-OP1 (200 nM) performed for 24 hours. By using specific antibodies directed versus his-tag and OP1 sequence, it was demonstrated that the construct is cleaved within cells presumably at the peptidase site, included at the N-terminal end. After 24 hours from treatment, the presence of TAT sequence was indirectly detected by his-tag signal within the nucleus while OP1 was observed at the plasma membrane. Moreover, the phosphorylation of SMAD1/5/8, that are the second messenger of BMP signalling, confirmed the interaction of OP1 sequence with BMPRs on the plasma membrane, as in parallel detected for hBMP7. The neurogenic potential was then evaluated by studies including MTS assay, neuritic outgrowth, and neurofilaments synthesis. No toxic effect was observed on 24 hours treated cells, while a reduction of cellular proliferation was detected from 72 hours in a concentration dependent manner. The combination of hTAT-OP1 with NGF induced a marked reduced proliferation in comparison with the samples treated with only hTAT-OP1. No significant differences was evaluated in samples treated with NGF/hTAT-OP1 or NGF/hBMP7 co-treatments. Although no neuritic outgrowth was induced by hTAT-OP1 or hBMP7 when used separately, a precocious and stimulator effect was detected at 24h in samples cotreated with NGF and hTAT-OP1 in comparison with the ones treated with NGF showing neurites only after 7 days of treatment. The co-treatments demonstrated also to increase the neurofilaments expression and improved their organization in comparison with NGF treatment. Taken together these data suggest that there is a synergy between hTAT-OP1 and NGF in neurogenic differentiation as an improved and precocious dendritic outgrowth, probably deriving from a crosstalk of factor signal ways. hTAT-OP1 is potentially useful for bone and neural regeneration applications.

La proteina osteogenica 1 (OP-1 o BMP-7) è un fattore di crescita multifunzionale di 431 amminoacidi appartenente alla famiglia delle proteine morfogenetiche dell’osso (BMP), un sottogruppo della superfamiglia del TGF-β. Secrete sottoforma di precursori fino a quattro volte più lunghi della forma matura, le BMP presentano all’estremità C-terminale un motivo contenente sette cisteine ..C…CXGXC…CC…CXCX.., che rappresenta la porzione attiva della molecola. Numerosi studi hanno dimostrato che le proteine BMP sono coinvolte non solo nello sviluppo della cartilagine e dell’osso ma anche nella formazione di tessuti di origine non osteogenica quali ad esempio il tessuto nervoso. Esse, infatti, sono coinvolte nelle prime fasi dello sviluppo del sistema nervoso centrale (SNC) e partecipano al processo neurorigenerativo in età adulta. Questo lavoro di tesi si è focalizzato sullo studio della proteina ricombinante umana di fusione hTAT-OP1, precedentemente preparata e caratterizzata su colture di preosteoblasti MC3T3E1. Il costrutto hTAT-OP1 è composto da 162 aminoacidi e comprende all’N-terminale (30 AA) una coda di 6 istidine seguita dalla sequenza TAT, un peptide che deriva dalle proteine del virus dell’HIV-1 ed è comunemente impiegato come dominio di trasduzione proteica, il sito di taglio per una peptidasi specifica (6 AA) e, al C-terminale, il dominio di sette cisteine (126 AA), essenziale per il corretto ripiegamento della proteina. La sua caratterizzazione ha previsto studi di trafficking cellulare, attività biologica come potenziale neurogenico su cellule di feocromocitoma di ratto PC12, una linea cellulare comunenemente usata per lo studio in vitro del differenziamento neurogenico. Lo studio di trafficking cellulare è stato eseguito mediante l’uso delle tecniche di western blotting e di immunofluorescenza. Dopo il trattamento di 24 ore con hTAT-OP1 (200nM), è stata dimostrata mediante western blotting la presenza intracellulare della proteina come molecola con peso molecolare di 18,5 kDa durante le prime 6 ore. Mediante l’impiego di anticorpi specifici per le sequenze his-tag e OP1, è stato dimostrato che il costrutto è tagliato in sede citoplasmatica in due peptidi, probabilmente a livello del sito peptidasico inserito nella regione N-terminale. Dopo 24 ore dal trattamento, la presenza di TAT è stata indirettamente determinata mediante il segnale di his-tag a livello nucleare mentre OP1 è stata osservata a livello della membrana citoplasmatica. Inoltre, la fosforilazione del complesso SMAD1/5/8, che agisce come secondo messaggero nella via del segnale BMP, ha confermato l’interazione della sequenza OP1 con i recettori di membrana BMPR, come dimostrato in parallelo per la proteina hBMP7. Successivamente, l’attività biologica come potenziale neurogenico è stata caratterizzata mediante studi di MTS, crescita neuritica ed espressione di neurofilamenti. Nessun effetto citotossico è stato osservato dopo 24 ore dall’inizio del trattamento, mentre una ridotta proliferazione cellulare è risultata a partire dalle 72 ore, e l’effetto è stato di tipo concentrazione dipendente. Inoltre, la combinazione di hTAT-OP1 con NGF ha comportato una più marcata riduzione della proliferazione in confronto con i campioni stimolati solo con hTAT-OP1. Nessuna differenza significativa è stata osservata tra i campioni trattati con NGF/hTAT-OP1 e NGF/hBMP7. Sebbene non sia stata osservata crescita neuritica dopo trattamento con la proteina hTAT-OP1 e hBMP7, un effetto precoce e stimolatorio è stato identificato a 24h nei campioni sottoposti al cotrattamento con hTAT-OP1 e NGF diversamente da quanto osservato nel controllo allestito con NGF dove la formazione dei neuriti è risultata in un tempo tardivo (7giorni). Il cotrattamento (hTAT-OP1+NGF) ha dimostrato, inoltre, di stimolare un’ alta espressione ed organizzazione dei neurofilamenti in confronto con le colture trattate solo con NGF. In conclusione, i risultati ottenuti in questo lavoro di tesi evidenziano che esiste una sinergia di azione nel differenziamento neurogenico tra hTAT-OP1 ed il fattore NGF, probabilmente dovuto ad un “crosstalk” tra le due vie di segnale e che tale sinergia comporta una più precoce crescita neuritica. Si intravedono prospettive applicative del costrutto hTAT-OP1 nel campo della rigenerazione ossea e neuronale.