SUMMARY: Loss of muscle mass occurs in many debilitating diseases including sepsis, burn injury, cancer, diabetes, heart and renal failure, but also in other catabolic conditions like denervation, immobilization, glucocorticoid treatment, or fasting. The reduction in muscle cell size is caused by an increase of the activity of proteolytic systems, such as the ubiquitin-proteasome system and the lysosome autophagic system. Gene expression studies revealed a set of genes which are commonly up- and down-regulated in different atrophying conditions. These genes are called atrophic related genes or atrogenes (Jagoe and Goldberg, 2001; LECKER et al., 2004). Two of the most induced genes, whose activation precedes muscle loss, are muscle-specific and encode for ubiquitin ligase. These two enzymes, named MURF1 and Atrogin-1, are rate-limiting in the ubiquitination process and therefore, regulate the proteasomal-dependent protein breakdown (Gomes et al., 2001). Atrogin-1 is controlled by FoxO transcription factors, which are in turn inhibited by the IGF1-PI3K-Akt pathway. In the absence of growth factors, like IGF1 or insulin, AKT is not activated and does not block FoxOs which can translocate into the nuclei and interact with promoters of their target genes (Sandri et al., 2004). In mammalian muscle, there are three FoxO transcription factors: FoxO1, FoxO3 and FoxO4. All FoxOs share the same “forkhead box” which contains the DNA-binding domain. Previous studies showed FoxO1 and FoxO3 to be involved in muscle atrophy (Kamei et al., 2004). However, it is completely unknown how many genes are required for FoxO-mediated muscle loss and whether these genes are or are not commonly regulated by both FoxO1 and FoxO3. In this study we proprosed to understand which are the atrophy-related genes target of FoxO1 and FoxO3. We set up ChIP technology in order to dissect in vivo, the interaction between FoxOs and promoters of FoxO’s target genes. This technique combines the specificity of immunoprecipitation in purifying specific proteins with the power of PCR to amplify specific sequences of DNA. First, we identified the potential FoxO1 and FoxO3 potential binding sites on the atrogin-1 promoter. Bioinformatic analysis of atrogin1 promoter showed that there are 14 potential FoxO binding sites. Second, we used a cell culture system to establish different parameters for a successful ChIP . We then moved to in vivo studies of both overexpressed FoxOs and endogenous FoxO proteins. Tibialis Anterior (TA) of adult CD1 mice were transfected with constitutively active HA tagged: ca-FoxO3 or ca-.FoxO1. After seven days muscles were collected, lysated and analysed for ChIP. ChIP studies demonstrated that FoxO3 strongly binds many sites of atrogin-1 promoter, while FoxO1 weakly interacts with only one site. To better understand which sites are physiologically relevant for atrogin-1 regulation endogenous FoxO1 and FoxO3 were immunoprecipitated. Fasting was used as a model of atrophy, since this model strongly activates FoxOs increasing atrogin-1 levels to more than 10 fold. ChIP experiments were performed on TA muscles of fed and starved mice. Interestingly, we could demonstrate by ChIP that FoxO3 preferentially binds chromatin at three sites of atrogin-1 promoter. These sites showed also an increase of histone acetylation during fasting. FoxO1 displayed a weak interaction with atrogin-1 promoter. To understand if both FoxOs are able to regulate atrogin-1 expression, we used a functional assay in which the atrogin-1 promoter was cloned upstream the luciferase gene. This reporter was transfected together with FoxO1 or FoxO3 in the tibialis anterior muscle and seven days later the assay was performed. This approach confirmed that FoxO3, but not FoxO1, could transactivate the atrogin-1 promoter. Since both FoxOs can induce muscle loss, the probability that other genes are required for muscle atrophy was seriously considered. Indeed overexpression of atrogin-1 per sè is not sufficient to induce muscle wasting. To understand how FoxOs cause muscle loss we focused on the atrophy-related genes which belong to other proteolytic systems and especially to autophagy-lysosome system. In fact LC3 and Binp3 are among the upregulated atrogenes and are rate limiting proteins in autophagosome formation. Their promoters contain several potential FoxO binding sites and ChIP experiments showed that FoxO3 binds chromatin of LC3 and Bnip3 promoters in specific sites during starvation. Functional promoter assay confirmed that FoxO3 binding on LC3 promoter is essential to activate transcription. Moreover, gain and loss of function experiments showed that FoxO3 regulates Binp3 protein levels. Altogether these findings show that FoxO3, but not FoxO1, coordinates the two major proteolytic systems of the cell by regulating the promoter activity of atrogin-1, LC3 and Binp3 genes. However these results have not clarified yet which atrogenes are regulated by FoxO1 and if there are other atrogenes under FoxO3 control. For this reason, we extend the ChIP assay to a genome wide analysis using a ChIP-on-Chip approach. This technique combines the Chromatin immunoprecipitation with hybridization on genomic microarray to allow a global analysis of protein–DNA interaction. The technique was set up using a cell culture system. Differentiated C2C12 myotubes were infected with adenovirus expressing HA tagged c.a.FoxO3 and 48 hours later a ChIP was performed using anti-HA antibody. The results of ChIP on Chip identified several binding sites on genome. Many of these regions are promoters for transcription factors, enzymes of different metabolic pathways and different kinases involved in regulation of different pathways. Importantly a FoxO3 binding site was detected in regulatory regions of other eight atrophy-related genes. When the function of this binding sites was validated it was found that 5 of these atrogenes were modulated by FoxO3. In conclusion, this PhD project establish the technical basis for the identification of the fundamental genes, under the control of a certain transcription factor, involved in the atrophy program. All these data will contribute to the development of new pharmacological strategy against muscle loss.

RIASSUNTO: Diverse patologie sistemiche, quali il diabete la sepsi, la cachessia neoplastica, e condizioni cataboliche, come la denervazione, l’immobilitazione, i trattamenti con glucocorticioidi o digiuno, portano conseguenza sono caratterizzate dalla perdita di massa muscolare, definita come atrofia muscolare. Questa perdita di massa muscolare è dovuto all’aumento dell’attività di sistemi proteolitici, come il sistema dell’ubiquitina-proteosoma e il sistema autofagico-lisosomiale. Studi di espressione genica hanno evidenziato l’esistenza di un gruppo comune di geni, sovra espressi o repressi in molte condizioni atrofiche. Questi geni sono stati chiamati geni dell’atrofia o atrogenes (Jagoe and Goldberg, 2001; LECKER et al., 2004). Tra questi spiccano due geni, MuRF-1 and atrogin-1, altamente espressi in molte condizioni atrofiche, che codificano per due ubiquitine ligasi muscolo specifiche. L’induzione induzione di atrogin-1 and MuRF-1 precede la perdita di massa muscolare e continua per tutto il processo. L’identificazione di queste due ubiquitine ligasi tra i geni dell’atrofia è importante in quanto esse costituiscono il la componente limitante del processo di ubiquitinizzazione, e, quindi, sono cruciali per la regolazione della degradazione proteica dipendente dal proteasome (Gomes et al., 2001). Atrogin-1 è regolato dai fattori trascrizionali FoxO che sono a loro volta inibiti dalla via di segnale di IGF1-PI3K-Akt. L’assenza di stimoli della crescita, come IGF1 o l’insulina, rende AKT non attivo e quindi non in grado di bloccare i fattori FoxO, che possono traslocare nel nucleo e interagire con i promotori dei geni bersaglio (Sandri et al., 2004). Nel tessuto muscolare dei mammiferi sono espressi tre fattori FoxO: FoxO1, FoxO3 and FoxO4, caratterizzati da un “forkhead box”, che comprende il dominio di legame con il DNA. I fattori FoxO riconoscono e legano, come monomeri, una stessa sequenza consensus sul DNA. Precedenti studi hanno dimostrato che FoxO1 e FoxO3 sono coinvolti nell’atrofia muscolare (Kamei et al., 2004; Sandri et al., 2004; Stitt et al., 2004). Non sono ancora stati resi noti quali siano i geni controllati dai entrambi i fattori FoxO o in modo specifico da uno dei due, che determinano la perdita di massa muscolare. L’identificazione di geni bersaglio dei FoxO è oggetto di numerosi studi, dato il coinvolgimento di questi fattori nel regolare svariate funzioni cellulari. Nell’ottica di comprendere in vivo l’interazione tra i FoxO e promotori dei geni bersaglio, ho applicato la tecnica della Chromatin immunoprecipitatetion (Das et al., 2004). Questa tecnica combina la specificità dell’immunoprecipitazione, per purificare proteine di interesse, con la potenza della reazione della PCR, per amplificare sequenze genomiche potenzialmente legate alla proteina studiata. Ho iniziato con l’analisi dell’interazione di FoxO1 e FoxO3 con una regione promotore di atrogin-1 contenente 14 siti potenziali per il legame di FoxO. Dopo una prima serie di esperimenti in virto per verificare l’efficienza della ChIP nel rilevare i legami dei fattori FoxO con il DNA, sono passata a studi in vivo, prima in condizioni di sovra espressione dei fattori FoxO e successivamente in un modello di atrofia. Mediante elettroporazione in muscoli tibialis anteriori di topi CD1, ho indotto l’espressione delle forme costitutivamente attive di FoxO1 e FoxO3 entrambi con all’epitopo HA. Dopo 7 giorni dall’operazione, i muscoli sono stati prelevati, lisati e trattati per essere utilizzati in esperimenti di ChIP. A seguito d’immunoprecipitazione, i frammenti di cromatina legati ai fattori FoxO sono stati amplificati mediante PCR utilizzando primer specifici per i 14 i siti potenziali di legame sul promotore di atrogin-1. Da questi esperimenti è emerso che FoxO3 si lega in molti siti sul promotore di atrogin-1, mentre per FoxO1 ho individuato una debole interazione su un unico sito. Per comprendere meglio quali siti sono fisiologicamente rilevanti nella regolazione di atrogin-1, ho analizzato l’interazione FoxO-promotore di atrogin-1 durante l’atrofia. Come modello di atrofia è stato scelto il digiuno, modello in cui c’è una notevole attivazione dei fattori FoxO e un incremento dell’espressione di atrogin-1 di circa 10 volte, rispetto alla condizione di controllo. Ho utilizzato per studi di ChIP il lisati muscolari di topi a 24 ore di digiuno e di topi di controllo. Questa serie di studi di ChIP hanno dimostrato che, durante il digiuno, FoxO3 lega in modo preferenziale tre regioni del promotore di atrogin-1, in cui aumentano i livelli di acetilazione della cromatina. L’analisi per FoxO1 rilevato solo una debole interazione di FoxO1 su una regione del promotore di atrogin-1. Per indagare la capacità di entrambi i fattori FoxO nel promuovere la trascrizione del gene, indipendentemente dal legame al promotore, ho utilizzato il sistema del gene reporter luciferasi fuso al promotore di atrogin-1. Dall’analisi al luminometro è emerso che FoxO3 promuove fortemente l’attività promotoriale, mentre FoxO 1 non ha alcuna capacità di transattivare atrogin-1. Questi risultati hanno suggerito il coinvolgimento di altri geni regolati dai FoxO nel programma atrofico. Come conferma di questa ipotesi è stato osservato che la sovra-espressione di atrogin-1 per sè non è sufficiente a indurre la perdita di massa muscolare. Ho preso in esame altri due geni del gruppo degli atrogenes, LC3 e Bnip3, compresi tra il gruppo degli atrogenes maggiormente indotti. Entrambi appartengono al sistema dell’autofagia mediata dai lisosomi. Le rispettive proteine codificate, LC3 and Bnip3, costituiscono due componenti cruciali per la formazione degli autofagosomi, strutture vescicolari deputate alla degradazione di porzioni citoplasmatiche. L’analisi dei promotori di LC3 e Bnip3 ha evidenziato molti siti potenziali per l’interazione con i fattori FoxO. Gli esperimenti condotti di ChIP hanno dimostrato che in condizioni di digiuno FoxO3 lega regioni specifiche di questi promotori. Gli studi funzionali dell’attività promotoriale hanno confermato che il legame di FoxO3 con il promotore li LC3 è essenziale per attivare la trascrizione del gene. Inoltre, mediante l’espressione di FoxO3 costitutivamente attivo e del dominante negativo, è emerso che FoxO3 regola i livelli proteici di Bnip3. Tuttavia questi risultati non hanno chiarito ancora quali sono i geni regolati da FoxO1 e se ci sono altri atrogenes controllati da FoxO3. Nell’obiettivo di estendere gli studi d’interazione proteina-DNA a più regioni promotori del genoma, è stato scelto di applicare la tecnica della ChIP on Chip. Questa tecnica combina la ChIP con l’ibridazione su microarrays genomici. Gli esperimenti di ChIP on Chip sono stati condotti in colture cellulari, utilizzando miotubi infettati con adenovirus esprimenti la forma costitutivamente attiva di FoxO3 con l’epitopo HA. I risultati ottenuti hanno messo in evidenza che FoxO3 interagisce con i promotori di geni che apprtengono a diverse vie del segnale e sono implicati in importanti processi metabolici e nella regolazione trascrizionale. E’ stato interessante notare che tra i promotori genici bersaglio di FoxO3 otto di questi sono promotori di atrogenes. Dall’analisi dei livelli di espressione di alcuni di questi geni bersaglio, è emerso il ruolo chiave di FoxO3 nella loro regolazione. Il mio lavoro svolto durante il dottorato pone le basi tecniche per l’identificazione di geni fondamentali al programma atrofico e costituisce un contributo per lo sviluppo di nuove strategie farmacologiche contro la perdita di massa muscolare.

Identification and Characterization of FoxO-target genes by Chromatin Immunoprecipitation / Milan, Giulia. - (2009 Feb 01).

Identification and Characterization of FoxO-target genes by Chromatin Immunoprecipitation

Milan, Giulia
2009

Abstract

RIASSUNTO: Diverse patologie sistemiche, quali il diabete la sepsi, la cachessia neoplastica, e condizioni cataboliche, come la denervazione, l’immobilitazione, i trattamenti con glucocorticioidi o digiuno, portano conseguenza sono caratterizzate dalla perdita di massa muscolare, definita come atrofia muscolare. Questa perdita di massa muscolare è dovuto all’aumento dell’attività di sistemi proteolitici, come il sistema dell’ubiquitina-proteosoma e il sistema autofagico-lisosomiale. Studi di espressione genica hanno evidenziato l’esistenza di un gruppo comune di geni, sovra espressi o repressi in molte condizioni atrofiche. Questi geni sono stati chiamati geni dell’atrofia o atrogenes (Jagoe and Goldberg, 2001; LECKER et al., 2004). Tra questi spiccano due geni, MuRF-1 and atrogin-1, altamente espressi in molte condizioni atrofiche, che codificano per due ubiquitine ligasi muscolo specifiche. L’induzione induzione di atrogin-1 and MuRF-1 precede la perdita di massa muscolare e continua per tutto il processo. L’identificazione di queste due ubiquitine ligasi tra i geni dell’atrofia è importante in quanto esse costituiscono il la componente limitante del processo di ubiquitinizzazione, e, quindi, sono cruciali per la regolazione della degradazione proteica dipendente dal proteasome (Gomes et al., 2001). Atrogin-1 è regolato dai fattori trascrizionali FoxO che sono a loro volta inibiti dalla via di segnale di IGF1-PI3K-Akt. L’assenza di stimoli della crescita, come IGF1 o l’insulina, rende AKT non attivo e quindi non in grado di bloccare i fattori FoxO, che possono traslocare nel nucleo e interagire con i promotori dei geni bersaglio (Sandri et al., 2004). Nel tessuto muscolare dei mammiferi sono espressi tre fattori FoxO: FoxO1, FoxO3 and FoxO4, caratterizzati da un “forkhead box”, che comprende il dominio di legame con il DNA. I fattori FoxO riconoscono e legano, come monomeri, una stessa sequenza consensus sul DNA. Precedenti studi hanno dimostrato che FoxO1 e FoxO3 sono coinvolti nell’atrofia muscolare (Kamei et al., 2004; Sandri et al., 2004; Stitt et al., 2004). Non sono ancora stati resi noti quali siano i geni controllati dai entrambi i fattori FoxO o in modo specifico da uno dei due, che determinano la perdita di massa muscolare. L’identificazione di geni bersaglio dei FoxO è oggetto di numerosi studi, dato il coinvolgimento di questi fattori nel regolare svariate funzioni cellulari. Nell’ottica di comprendere in vivo l’interazione tra i FoxO e promotori dei geni bersaglio, ho applicato la tecnica della Chromatin immunoprecipitatetion (Das et al., 2004). Questa tecnica combina la specificità dell’immunoprecipitazione, per purificare proteine di interesse, con la potenza della reazione della PCR, per amplificare sequenze genomiche potenzialmente legate alla proteina studiata. Ho iniziato con l’analisi dell’interazione di FoxO1 e FoxO3 con una regione promotore di atrogin-1 contenente 14 siti potenziali per il legame di FoxO. Dopo una prima serie di esperimenti in virto per verificare l’efficienza della ChIP nel rilevare i legami dei fattori FoxO con il DNA, sono passata a studi in vivo, prima in condizioni di sovra espressione dei fattori FoxO e successivamente in un modello di atrofia. Mediante elettroporazione in muscoli tibialis anteriori di topi CD1, ho indotto l’espressione delle forme costitutivamente attive di FoxO1 e FoxO3 entrambi con all’epitopo HA. Dopo 7 giorni dall’operazione, i muscoli sono stati prelevati, lisati e trattati per essere utilizzati in esperimenti di ChIP. A seguito d’immunoprecipitazione, i frammenti di cromatina legati ai fattori FoxO sono stati amplificati mediante PCR utilizzando primer specifici per i 14 i siti potenziali di legame sul promotore di atrogin-1. Da questi esperimenti è emerso che FoxO3 si lega in molti siti sul promotore di atrogin-1, mentre per FoxO1 ho individuato una debole interazione su un unico sito. Per comprendere meglio quali siti sono fisiologicamente rilevanti nella regolazione di atrogin-1, ho analizzato l’interazione FoxO-promotore di atrogin-1 durante l’atrofia. Come modello di atrofia è stato scelto il digiuno, modello in cui c’è una notevole attivazione dei fattori FoxO e un incremento dell’espressione di atrogin-1 di circa 10 volte, rispetto alla condizione di controllo. Ho utilizzato per studi di ChIP il lisati muscolari di topi a 24 ore di digiuno e di topi di controllo. Questa serie di studi di ChIP hanno dimostrato che, durante il digiuno, FoxO3 lega in modo preferenziale tre regioni del promotore di atrogin-1, in cui aumentano i livelli di acetilazione della cromatina. L’analisi per FoxO1 rilevato solo una debole interazione di FoxO1 su una regione del promotore di atrogin-1. Per indagare la capacità di entrambi i fattori FoxO nel promuovere la trascrizione del gene, indipendentemente dal legame al promotore, ho utilizzato il sistema del gene reporter luciferasi fuso al promotore di atrogin-1. Dall’analisi al luminometro è emerso che FoxO3 promuove fortemente l’attività promotoriale, mentre FoxO 1 non ha alcuna capacità di transattivare atrogin-1. Questi risultati hanno suggerito il coinvolgimento di altri geni regolati dai FoxO nel programma atrofico. Come conferma di questa ipotesi è stato osservato che la sovra-espressione di atrogin-1 per sè non è sufficiente a indurre la perdita di massa muscolare. Ho preso in esame altri due geni del gruppo degli atrogenes, LC3 e Bnip3, compresi tra il gruppo degli atrogenes maggiormente indotti. Entrambi appartengono al sistema dell’autofagia mediata dai lisosomi. Le rispettive proteine codificate, LC3 and Bnip3, costituiscono due componenti cruciali per la formazione degli autofagosomi, strutture vescicolari deputate alla degradazione di porzioni citoplasmatiche. L’analisi dei promotori di LC3 e Bnip3 ha evidenziato molti siti potenziali per l’interazione con i fattori FoxO. Gli esperimenti condotti di ChIP hanno dimostrato che in condizioni di digiuno FoxO3 lega regioni specifiche di questi promotori. Gli studi funzionali dell’attività promotoriale hanno confermato che il legame di FoxO3 con il promotore li LC3 è essenziale per attivare la trascrizione del gene. Inoltre, mediante l’espressione di FoxO3 costitutivamente attivo e del dominante negativo, è emerso che FoxO3 regola i livelli proteici di Bnip3. Tuttavia questi risultati non hanno chiarito ancora quali sono i geni regolati da FoxO1 e se ci sono altri atrogenes controllati da FoxO3. Nell’obiettivo di estendere gli studi d’interazione proteina-DNA a più regioni promotori del genoma, è stato scelto di applicare la tecnica della ChIP on Chip. Questa tecnica combina la ChIP con l’ibridazione su microarrays genomici. Gli esperimenti di ChIP on Chip sono stati condotti in colture cellulari, utilizzando miotubi infettati con adenovirus esprimenti la forma costitutivamente attiva di FoxO3 con l’epitopo HA. I risultati ottenuti hanno messo in evidenza che FoxO3 interagisce con i promotori di geni che apprtengono a diverse vie del segnale e sono implicati in importanti processi metabolici e nella regolazione trascrizionale. E’ stato interessante notare che tra i promotori genici bersaglio di FoxO3 otto di questi sono promotori di atrogenes. Dall’analisi dei livelli di espressione di alcuni di questi geni bersaglio, è emerso il ruolo chiave di FoxO3 nella loro regolazione. Il mio lavoro svolto durante il dottorato pone le basi tecniche per l’identificazione di geni fondamentali al programma atrofico e costituisce un contributo per lo sviluppo di nuove strategie farmacologiche contro la perdita di massa muscolare.
1-feb-2009
SUMMARY: Loss of muscle mass occurs in many debilitating diseases including sepsis, burn injury, cancer, diabetes, heart and renal failure, but also in other catabolic conditions like denervation, immobilization, glucocorticoid treatment, or fasting. The reduction in muscle cell size is caused by an increase of the activity of proteolytic systems, such as the ubiquitin-proteasome system and the lysosome autophagic system. Gene expression studies revealed a set of genes which are commonly up- and down-regulated in different atrophying conditions. These genes are called atrophic related genes or atrogenes (Jagoe and Goldberg, 2001; LECKER et al., 2004). Two of the most induced genes, whose activation precedes muscle loss, are muscle-specific and encode for ubiquitin ligase. These two enzymes, named MURF1 and Atrogin-1, are rate-limiting in the ubiquitination process and therefore, regulate the proteasomal-dependent protein breakdown (Gomes et al., 2001). Atrogin-1 is controlled by FoxO transcription factors, which are in turn inhibited by the IGF1-PI3K-Akt pathway. In the absence of growth factors, like IGF1 or insulin, AKT is not activated and does not block FoxOs which can translocate into the nuclei and interact with promoters of their target genes (Sandri et al., 2004). In mammalian muscle, there are three FoxO transcription factors: FoxO1, FoxO3 and FoxO4. All FoxOs share the same “forkhead box” which contains the DNA-binding domain. Previous studies showed FoxO1 and FoxO3 to be involved in muscle atrophy (Kamei et al., 2004). However, it is completely unknown how many genes are required for FoxO-mediated muscle loss and whether these genes are or are not commonly regulated by both FoxO1 and FoxO3. In this study we proprosed to understand which are the atrophy-related genes target of FoxO1 and FoxO3. We set up ChIP technology in order to dissect in vivo, the interaction between FoxOs and promoters of FoxO’s target genes. This technique combines the specificity of immunoprecipitation in purifying specific proteins with the power of PCR to amplify specific sequences of DNA. First, we identified the potential FoxO1 and FoxO3 potential binding sites on the atrogin-1 promoter. Bioinformatic analysis of atrogin1 promoter showed that there are 14 potential FoxO binding sites. Second, we used a cell culture system to establish different parameters for a successful ChIP . We then moved to in vivo studies of both overexpressed FoxOs and endogenous FoxO proteins. Tibialis Anterior (TA) of adult CD1 mice were transfected with constitutively active HA tagged: ca-FoxO3 or ca-.FoxO1. After seven days muscles were collected, lysated and analysed for ChIP. ChIP studies demonstrated that FoxO3 strongly binds many sites of atrogin-1 promoter, while FoxO1 weakly interacts with only one site. To better understand which sites are physiologically relevant for atrogin-1 regulation endogenous FoxO1 and FoxO3 were immunoprecipitated. Fasting was used as a model of atrophy, since this model strongly activates FoxOs increasing atrogin-1 levels to more than 10 fold. ChIP experiments were performed on TA muscles of fed and starved mice. Interestingly, we could demonstrate by ChIP that FoxO3 preferentially binds chromatin at three sites of atrogin-1 promoter. These sites showed also an increase of histone acetylation during fasting. FoxO1 displayed a weak interaction with atrogin-1 promoter. To understand if both FoxOs are able to regulate atrogin-1 expression, we used a functional assay in which the atrogin-1 promoter was cloned upstream the luciferase gene. This reporter was transfected together with FoxO1 or FoxO3 in the tibialis anterior muscle and seven days later the assay was performed. This approach confirmed that FoxO3, but not FoxO1, could transactivate the atrogin-1 promoter. Since both FoxOs can induce muscle loss, the probability that other genes are required for muscle atrophy was seriously considered. Indeed overexpression of atrogin-1 per sè is not sufficient to induce muscle wasting. To understand how FoxOs cause muscle loss we focused on the atrophy-related genes which belong to other proteolytic systems and especially to autophagy-lysosome system. In fact LC3 and Binp3 are among the upregulated atrogenes and are rate limiting proteins in autophagosome formation. Their promoters contain several potential FoxO binding sites and ChIP experiments showed that FoxO3 binds chromatin of LC3 and Bnip3 promoters in specific sites during starvation. Functional promoter assay confirmed that FoxO3 binding on LC3 promoter is essential to activate transcription. Moreover, gain and loss of function experiments showed that FoxO3 regulates Binp3 protein levels. Altogether these findings show that FoxO3, but not FoxO1, coordinates the two major proteolytic systems of the cell by regulating the promoter activity of atrogin-1, LC3 and Binp3 genes. However these results have not clarified yet which atrogenes are regulated by FoxO1 and if there are other atrogenes under FoxO3 control. For this reason, we extend the ChIP assay to a genome wide analysis using a ChIP-on-Chip approach. This technique combines the Chromatin immunoprecipitation with hybridization on genomic microarray to allow a global analysis of protein–DNA interaction. The technique was set up using a cell culture system. Differentiated C2C12 myotubes were infected with adenovirus expressing HA tagged c.a.FoxO3 and 48 hours later a ChIP was performed using anti-HA antibody. The results of ChIP on Chip identified several binding sites on genome. Many of these regions are promoters for transcription factors, enzymes of different metabolic pathways and different kinases involved in regulation of different pathways. Importantly a FoxO3 binding site was detected in regulatory regions of other eight atrophy-related genes. When the function of this binding sites was validated it was found that 5 of these atrogenes were modulated by FoxO3. In conclusion, this PhD project establish the technical basis for the identification of the fundamental genes, under the control of a certain transcription factor, involved in the atrophy program. All these data will contribute to the development of new pharmacological strategy against muscle loss.
atrophy, atrogenes, FoxO, Chromatin Immunoprecipitation
Identification and Characterization of FoxO-target genes by Chromatin Immunoprecipitation / Milan, Giulia. - (2009 Feb 01).
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