Agrobacterium-mediated transformation of Jatropha curcas to overexpress a gene involved in the triglyceride biosynthetic pathway

Negative environmental consequences of fossil fuels and concerns about petroleum supplies have spurred the search for renewable transportation biofuels. To be a valuable alternative, a biofuel should provide a net energy gain, have environmental benefits, be economically competitive, and be producible in large quantities without reducing food supplies. Biodiesel is the most used alternative biofuel nowadays, along with bioethanol, in the world. Parent oil used in making biodiesel consists of triglycerides in which three fatty acid molecules are esterified with a molecule of glycerol. The trans-esterification produces methyl esters of fatty acids, which are biodiesel, and glycerol. The increasing demand of plant species producing oil rich seeds (i.e. Brassica napus, Glycine max and Helianthus annuus) is leading to the reduction of agricultural areas assigned to crops grown for human nutrition, and it is causing the increase in food prices. The aim of the proposed project (in collaboration with Geneticlab S.r.l.) is to design reliable protocols to produce biomass and to induce lipid accumulation in cell cultures obtained from a plant species known as high oleic: Jatropha curcas. This species has attracted the interest of various developmental agencies in the tropics and subtropics due to its easy adaptability to semi-arid marginal sites, use of the oil as a diesel fuel substitute and its use in erosion control. J. curcas is monoecious, with male and female flowers on the same plant, and its center of origin are Mexico and Central America. In its natural area of distribution, the species is most abundant in tropical savanna and monsoon climates and in temperate climates without a dry season and with a hot summer. The experimental approach followed two different directions: a) the establishment of protocols able to stimulate cells proliferation from leaf and seed explants; b) the search of easy and fast protocols useful to clonally propagate this species. Cell proliferation was obtained, on solid media and then in liquid media, in many different conditions of salt and phytohormone combinations. A suspension cell culture was characterized, and the biomass grew of seven fold in about three weeks, before entering stationary/death phase. On the other hand, in vivo propagation through cuttings was carried out from plants of different age and origin. The hardwood part of the plants is the most efficient in rooting and outliving. Organogenesis via a callus-mediated step and plant regeneration were achieved in vitro and acclimatization to natural environment was performed. Agrobacterium-mediated transformation was planned in order to overexpress an enzyme involved in the plant triglycerides biosynthesis pathway, because it could be a potential application for the production of plant cell cultures accumulating triglycerides. The Arabidopsis thaliana gene coding for the diacylglycerol acyltransferase enzyme (DGAT) has been cloned into the delivery plasmid pGreen0029 (KanR), under the control of the constitutive CaMV 35S promoter and three plasmids with different constructs have been obtained: pG29Y, harbouring the gene coding for the YFP; pG29HD, harbouring the gene coding for the DGAT with the HA flag at the 5’-terminal; pG29HDY, harbouring the fusion product of the two coding sequences considered before. Cell cultures transformed with pG29Y and pG29HDY allowed us to observe a different localized fluorescent signal, which could be explained with the expected insertion of DGAT in the ER membrane. A quantification of storage lipid content was set up. This colorimetric assay was performed on seeds and the cultured cell lines in order to quantify the intracellular triglycerides content. The lipid test will be performed on transformed Jatropha calli and regenerated plants to evaluate the result on lipid accumulation in tissues other than seeds. Some obtained results from this 3-years project have been applied with good results by Geneticlab company in the scale-up of cell cultures from laboratory to industrial level.

Le conseguenze negative derivate dall’uso dei combustibili fossili e la preoccupazione sulla durata delle riserve petrolifere hanno stimolato la ricerca di fonti di energia rinnovabili. Un biocarburante, per essere considerato una valida alternativa, deve essere poco inquinante, economicamente competitivo e deve poter essere prodotto in grandi quantità senza intaccare le risorse alimentari. Il biodiesel è uno dei biocarburanti più utilizzati al mondo e l’olio da cui deriva è costituito di trigliceridi (TAG), ovvero molecole di glicerolo esterificate con tre acidi grassi. La trans- esterificazione con metanolo di questi trigliceridi produce metil esteri di acidi grassi, che costituiscono il biodiesel vero e proprio, e glicerolo. La crescente domanda di specie in grado di produrre semi oleaginosi (come Brassica napus, Glycine max e Helianthus annuus) sta causando la riduzione delle aree agricole destinate alla coltivazione di colture edibili, causando l’aumento dei prezzi degli alimenti. L’obiettivo del progetto, in collaborazione con Geneticlab S.r.l., è l’ottenimento di protocolli in grado di indurre la produzione di biomassa e l’accumulo di lipidi in colture cellulari derivate da espianti di Jatropha curcas. Questa specie si adatta facilmente a climi semi aridi, è in grado di crescere su suoli poveri e marginali, è molto utile per combattere l’erosione e accumula molti trigliceridi nei semi. J. curcas è monoica, con fiori maschili e femminili sulla stessa infiorescenza; è una pianta originaria del Mexico o comunque del Centro America. Questa specie viene coltivata nelle zone tropicali e sub-tropicali e nei climi temperati caratterizzati da un’estate calda e l’assenza di una stagione secca. L’approccio sperimentale ha seguito due diverse direzioni: a) la messa a punto di protocolli in grado di stimolare la proliferazione cellulare a partire da diversi tipi di espianto; b) la ricerca di protocolli veloci e ripetibili utili alla propagazione della specie. La proliferazione cellulare è stata ottenuta, sia su mezzo solido che liquido con diverse concentrazioni di sali e di fitoregolatori. Le colture cellulari in sospensione sono state caratterizzate dimostrando che la biomassa ottenuta può aumentare fino a più di 7 volte, rispetto all’inoculo iniziale, in 3 settimane . La propagazione per talea è stata eseguita a partire da esemplari di diversa età e origine e la parte legnosa della pianta si è dimostrata essere la più efficiente nella radicazione. L’organogenesi da callo e la rigenerazione dell’intero individuo sono state ottenute in vitro; le piante così rigenerate riescono ad acclimatarsi all’ambiente naturale. La trasformazione mediata da Agrobacterium tumefaciens è stata programmata per sovraesprimere un enzima coinvolto nella via biosintetica dei trigliceridi. Questa strategia potrebbe permettere l’ottenimento di colture cellulari in grado di accumulare trigliceridi in grandi quantità. Il gene codificante la diacilglicerolo aciltransferasi (DGAT) di A. thaliana è stato clonato nel vettore pG0029 sotto il controllo del promotore costitutivo 35S e, in particolare, sono stati preparati tre diversi vettori plasmidici: nel plasmide pG29Y è inserita la sequenza codificante per la proteina fluorescente YFP; nel plasmide pG29HD quella codificante per l’enzima DGAT e nel plasmide pG29HDY quella codificante per il prodotto di fusione DGAT::YFP. Colture cellulari trasformate con i plasmidi pG29Y e pG29HDY hanno permesso di osservare un segnale di fluorescenza con una diversa localizzazione sub-cellulare per i due costrutti; è infatti noto da dati presenti in letteratura che l’enzima DGAT svolge la sua funzione nella membrana del reticolo endoplasmatico. È stato inoltre ottimizzato un saggio utile alla quantificazione dei trigliceridi intracellulari che ha permesso di valutare l’accumulo di TAG nei semi e nelle colture cellulari di J. curcas. Questo saggio verrà eseguito sulle colture cellulari e sui diversi tessuti delle piante trasformati. Alcuni dei risultati ottenuti durante i 3 anni di questo progetto sono stati applicati con buoni risultati dalla ditta Geneticlab S.r.l., permettendo il trasferimento di tecnologia dalla scala di laboratorio a quella industriale.