Role of miR-182 in neoplastic progression of colorectal cancer

Numerous studies have demonstrated that aberrant expressions of specific microRNAs (miRNAs) are involved in many cancer types including colorectal cancer (CRC). In particular, in a previous study we integrated miRNA and target gene expression data obtained from chip array by comparing normal colon tissue, primary tumor and liver metastasis, and we focused our attention on post-transcriptional regulatory networks with differentially expressed miRNAs and their supported relations with target genes. We demonstrated that miR-182 was one of the most up-regulated miRNAs in primary CRC compared to normal colon mucosa. Starting from these premises, the project was focused on the following tasks: 1) Identification of miRNA biomarkers for CRC monitoring and screening in colon cancer patients; 2) Analysis of the functional effects of miR-182 inhibition in CRC cell lines characterized by a different in vivo tumorigenic behavior. Regarding the first task in my first year of PhD we published a paper (68, Appendix 1) to confirm the involvement of miR-182 in CRC development and progression. In particular, a total of 240 histopathological and 51 plasma samples were included in this study. We observed a significant overexpression of miR-182 in CRC primary tumor compared to normal colon mucosa, which is also maintained in CRC liver metastases. Then, we also demonstrated that plasma miR-182 levels are significantly higher in CRC patients than in healthy controls. Moreover, miR-182 plasma levels were significantly reduced in post-operative samples after radical hepatic metastasectomy, compared to pre-operative samples. These results indicated that the evaluation of circulating miR-182 levels could be a promising approach to improve the repertoire of non-invasive blood based biomarkers for CRC monitoring and screening. To strengthen these evidences, we carried out a prospective study in stage I-II (N0 M0) colon cancer. We preselected four strongly up-regulated miRNAs involved in the same post-transcriptional sub-network (miR-18a, miR-21, miR-182 and miR-183) and the most down-regulated miRNA (miR-139) and we confirmed that all the selected miRNAs are significantly modulated in colon cancer compared to normal colon mucosa. Moreover, we observed that miR-182, miR-183 and miR-139 were not modulated in inflammatory tissue compared to colon mucosa; by contrast miR-18a and miR-21 are significantly up-regulated also in the inflammation-related process. To investigate whether the selected miRNAs could be useful to predict tumor relapse the patients were subdivided in Recurrent and Non Recurrent groups within 55 months. We calculated 10 ratios between the expression values of all possible miRNA pairs, applying the miRNA ratio approach both in the tumor tissue and in the adjacent normal mucosa. None of the miRNA ratios resulted predictive when evaluated in the colon cancer tissue, instead three miRNA ratios evaluated in the tumor-adjacent mucosa were found to be significant predictors of relapse by 55 months from resection: miR-21/miR-183, miR-18a/miR-182 and miR-18a/miR-183. Manuscript submitted. Regarding the second task, to gain insights in the functional role played by miR-182 in the tumorigenesis we investigated the effects of miR-182 inhibition. To this end, we used two CRC cell lines as in vitro models: MICOL-14h-tert (an in vivo non-tumorigenic cell line derived from a lymph node metastasis of rectal cancer,) and its in vivo tumorigenic variant MICOL-14tum (or TC22). We carried out transfection experiments for the transient inhibition of miR-182 and we observed a significant increase of cell apoptosis in both cell lines after the treatment. We confirmed the results with cleaved PARP and Caspase-3 proteins detection by Western Blot. Therefore, we evaluated the effect of miR-182 inhibition on in vivo tumor growth. To this end, we injected subcutaneously the TC22 cells treated with the anti-miR-182 in NOD/SCID mice and, after a week, we performed also an in vivo intra-tumor injection of miR-182 inhibitor to maintain the silencing. Interestingly, the inhibition of miR-182 significantly reduced the size of the tumor, and the obtained mass exhibited a pattern of features as less aggressive tumors compared to controls. Manuscript in preparation. In conclusions: - miR-182 expression levels can be followed in tissues and plasma of CRC patients. In particular, circulating miR-182 evaluation could be a promising approach to enhance the repertoire for blood based biomarkers in non-invasive CRC monitoring and screening; - the panel of selected miRNAs were significantly regulated also in the early phases of the CRC tumor process extending to stage I-II the results obtained in our previous work in stage IV CRC; - not a single miRNA, but rather a coordinated alteration of four miRNAs may be useful to predict recurrence after resection in early CRC when evaluate in the normal mucosa adjacent to tumor; - in CRC cell lines the expression level of miR-182 is higher in in vivo tumorigenic variant, suggesting a role of this miRNA in tumor aggressiveness. MiR-182 seems to be involved in increasing the survival of cancer cells and enhance the tumor growth.

Numerosi studi hanno dimostrato che l’alterata espressione di specifici microRNA (miRNAs) è coinvolta in molti tipi di tumore, incluso il cancro del colon-retto (CRC). In particolare, in un precedente studio abbiamo integrato dati di espressione di miRNA e geni ottenuti da chip array, confrontando tessuto colico normale, tumore primario e metastasi epatiche, e abbiamo concentrato la nostra attenzione sulle reti regolatorie post-trascrizionali con miRNA differenzialmente espressi e le loro relazioni supportate con i geni bersaglio. Abbiamo dimostrato che il miR-182 risultava essere uno dei più up-regolati nel CRC primario rispetto alla mucosa normale di colon. Partendo da questi persupposti, gli obiettivi del progetto sono stati i seguenti: 1) Identificazione di miRNAs come possibili biomarcatori per il monitoraggio e lo screening nei pazienti con tumore del colon; 2) Analisi degli effetti funzionali indotti dall'inibizione del miR-182 in linee cellulari di tumore del colon caratterizzate da un diverso comportamento tumorigenico in vivo. Per quanto riguarda il primo obiettivo, abbiamo pubblicato un lavoro (68, appendice 1) in cui si conferma il coinvolgimento del miR-182 nello sviluppo e nella progressione del CRC. In particolare, in questo studio sono stati inclusi complessivamente 240 campioni istopatologici e 51 plasmatici. Abbiamo osservato una significativa sovra-espressione di miR-182 nel tumore primario rispetto alla mucosa normale di colon, la quale si mantiene anche nelle metastasi epatiche. Abbiamo anche dimostrato che i livelli plasmatici di miR-182 sono significativamente più elevati nei pazienti con CRC rispetto ai controlli sani. Inoltre, i livelli di miR-182 nel plasma si riducono significativamente dopo la metastasectomia radicale epatica. Questi risultati suggeriscono che la valutazione dei livelli di miR-182 circolante potrebbero essere un approccio promettente per ampliare la disponibilità di biomarcatori non invasivi per il monitoraggio e lo screening di questi pazienti. Per rafforzare queste evidenze, abbiamo effettuato uno studio prospettico su una casistica indipendente di CRC allo stadio I-II (N0 M0) e abbiamo pre-selezionato alcuni miRNA fortemente regolati: il miR-139 e 4 coinvolti nella stessa rete post-trascrizionale (miR-18a, miR-21, miR-182 e miR-183). Questi 5 miRNA sono significativamente modulati nel tessuto tumorale rispetto alla mucosa normale di colon. Inoltre, abbiamo osservato che miR-182, miR-183 e miR-139 non risultano modulati nel tessuto infiammatorio rispetto alla mucosa normale; per contro, il miR-18a e il miR-21 sono significativamente regolati anche nel processo legato all'infiammazione. Per valutare il possibile ruolo predittivo di questi miRNA i pazienti sono stati suddivisi in gruppi ricorrenti e non ricorrenti entro 55 mesi. Abbiamo quindi calcolato 10 ratio tra i valori di espressione di tutte le possibili coppie di miRNA, sia nel tessuto tumorale che nella mucosa normale adiacente. Nessuno dei miRNA ratio è risultato predittivo quando valutato nel tessuto tumorale; tre miRNA ratio valutati nella mucosa adiacente al tumore risultano, invece, predittori significativi della ricaduta a 55 mesi dalla resezione: miR-21/miR-183, miR-18a/miR-182 e miR-18a/miR-183. Manuscript submitted. Per quanto riguarda il secondo obiettivo, per approfondire il ruolo funzionale svolto dal miR-182 nella tumorigenesi abbiamo valutato gli effetti indotti dalla sua inibizione. A questo scopo, abbiamo utilizzato due linee di CRC come modello in vitro: MICOL-14h-tert (una linea cellulare non tumorigenica in vivo derivata da metastasi linfonodali del cancro rettale), e la sua variante tumorigenica in vivo MICOL-14tum ( o TC22). Abbiamo effettuato esperimenti di trasfezione per l'inibizione transitoria del miR-182 e abbiamo osservato un significativo aumento dell'apoptosi in entrambe le linee cellulari dopo il trattamento. Abbiamo confermato i risultati mediante l’identificazione di PARP e Caspasi-3 in Western Blot. Inoltre abbiamo valutato l'effetto dell'inibizione di miR-182 sulla crescita tumorale in vivo. A tal fine abbiamo eseguito inoculi sottocute di cellule TC22 trattate con anti-miR-182 in topi NOD/SCID, e dopo una settimana abbiamo eseguito un'ulteriore iniezione intra-tumorale in vivo di anti-miR-182 per mantenere il silenziamento. È interessante notare che l'inibizione del miR-182 riduce significativamente la dimensione del tumore, il quale presenta caratteri di minore aggressività rispetto ai controlli. Manuscript in preparation. In conclusione: - i livelli di espressione del miR-182 possono essere rilevati nel tessuto e nel plasma dei pazienti affetti da CRC. In particolare, la valutazione del miR-182 circolante potrebbe essere un approccio promettente per migliorare il repertorio di biomarcatori non invasivi per il monitoraggio e lo screening; - il gruppo di miRNA selezionati è risultato significativamente regolato anche nelle fasi iniziali del processo tumorale, estendendo alla fase I-II i risultati già ottenuti nei CRC fase IV; - non un singolo miRNA, ma piuttosto un'alterazione coordinata di quattro miRNA può essere utile per prevedere la ricorrenza dopo la resezione nel CRC precoce quando valutata nella mucosa normale adiacente al tumore; - nelle linee cellulari di CRC il livello di espressione del miR-182 è più elevato nella variante tumorigenica in vivo, suggerendo un suo ruolo nell’aggressività tumorale. In particolare sembra essere coinvolto nel sostenere la sopravvivenza delle cellule tumorali e la crescita del tumore stesso.