Genetic analyses for the restoration of the Beluga sturgeon (Huso huso) in the Po river basin

The Beluga sturgeon (Huso huso) is a locally-extinct species in the Adriatic region, mainly due to anthropic factors. In order to successfully re-introduce this species, strong genetic bases are needed to set up a proper reintroduction plan that will lead to achieve a self-sustaining population as genetically similar as possible to those previously living in the Adriatic basin. On this basis, a phylogeographic investigation was performed at a mitochondrial level (for subsequent comparison with museum samples of the Adriatic population) in 119 Beluga specimens from 5 non-extinct populations from Black Sea and Caspian Sea basins. At a nuclear level, 110 specimens were analyzed at microsatellite markers and 54 at SNP loci through genome wide 2b-RAD approach. Based on genetic analyses of a 367 bp region of the mitochondrial D-loop, of 16 microsatellite loci and of 4736 polymorphic loci from RAD-seq, a significant geographically-related structure between Black Sea and Caspian Sea was observed. These analyses have shown the lack of a clear-cut differentiation of the population from the Sea of Azov from all the other populations, probably as result of the combined effect of the connection with the Black Sea and of the intensive release of individuals originating from the Caspian Sea basin. In this study, two distinct haplotypes of Adriatic Beluga have been identified from two museum specimens of H. huso. These haplotypes differed from all the 39 haplotypes identified in contemporary populations. Although the lack of shared haplotypes is not sufficient to demonstrate the existence of a former genetically distinct population in the Adriatic basin, this hypothesis is supported by the fact that the two museum haplotypes observed in three individuals were observed only in the Adriatic and were very similar one to each other. Two molecular tools have been developed for both the conservation and management of aquaculture stocks: 1) a species-specific nuclear tool for the identification of the Beluga based on a diagnostic SNP identified within a predicted intron of the Ribosomal Protein S7 (RP2S7) gene; 2) a panel of microsatellite loci developed for relatedness analyses. The identified RP2S6 marker resulted as highly reliable for routine controls in the Beluga sturgeon, given its high efficiency and simplicity based on its single-locus diagnostic approach with a fast and easy visualization by agarose gel from a single PCR. The nuclear RP2S6 marker, in combination with pairs of species-specific primers previously developed for numerous and different sturgeon species on locus RP1S7, guarantees also the identification of various hybrids that include Beluga sturgeon as a maternal or paternal species. On the other hand, the selected panel of microsatellite loci will be extremely useful to perform relatedness analysis among individuals reared in aquaculture in Italy, and potentially selectable for the establishment of captive broodstocks. The present study allowed for the first time to depict the geographical pattern of genetic distribution across the entire geographical range of the Beluga. For what concerns the comparison of museum samples from the Adriatic Sea, the limited amount of information collected did not allow to unambiguously allocate these animals to any of the main basins. For this reason, the choice of the best source population cannot be based only on genetic evaluations, but should also take into consideration also other factors, such as the geographical proximity or the ecological exchangeability. In any case, the genetic differentiation observed between basins raises the opportunity to avoid admixing individuals from the two main basins for the establishment of captive broodstocks as a prudential strategy for outbreeding avoidance. For what concerns the reintroduction of the Beluga in the Adriatic area, the need of a careful genetic analysis of all the individuals that will be involved in future rehabilitation programs is a clear outcome of the present work. The availability of a genetic tool for the assessment of species purity as well as of relatedness, lays the bases for a properly conducted management of this critically-endangered species in Italy.

Lo storione Beluga è una specie di storione ormai estinta nella regione Adriatica. Per riuscire a reintrodurre efficacemente questa specie, è necessario ideare un adeguato piano che abbia solide basi genetiche al fine di ottenere una popolazione autosufficiente e il più possibile geneticamente simile a quella in precedenza presente nel bacino del mar Adriatico. A tal fine, è stato effettuato uno studio filogeografico a livello mitocondriale su 119 individui di Beluga appartenenti a 5 popolazioni attualmente esistenti nei bacini del Mar Nero e Caspio per poter successivamente effettuare un confronto con campioni museali appartenenti alla popolazione Adriatica. A livello nucleare, invece, sono stati analizzati 110 individui tramite analisi a livello di loci microsatellite, e 54 individui tramite analisi a livello di loci SNP tramite un approccio genome-wide (2b-RAD). Attraverso analisi di una regione di 367 bp del D-loop mitocondriale, di 16 loci microsatellite e di 4736 loci polimorfici ottenuti tramite RAD-seq, è stato possibile individuare la presenza di una struttura genetica fra i bacini geograficamente distinti del Mar Nero e Caspio. Le analisi effettuate hanno inoltre evidenziato, per la popolazione del Mar d’Azov, la mancanza di una netta e chiara differenziazione rispetto alle altre popolazioni; ciò può essere spiegato dal fatto che tale popolazione risulta geograficamente connessa al bacino del Mar Nero e, inoltre, è stata oggetto di azioni di rilascio di individui provenienti dal bacino del Mar Caspio. In questo studio, sono stati inoltre identificati due diversi aplotipi di Beluga Adriatico a partire da due distinti campioni museali di H.huso. Tali aplotipi differiscono dagli altri 39 identificati nelle popolazioni attualmente esistenti. Nonostante la mancanza di aplotipi condivisi non sia sufficiente per dimostrare la presenza nel Mar Adriatico di una popolazione geneticamente distinta, questa ipotesi è supportata dal fatto che i due aplotipi identificati siano circoscritti unicamente agli individui Adriatici e risultino essere altamente simili fra di loro. Due differenti tecniche molecolari sono state sviluppate per il controllo e la conservazione degli stock di acquacoltura: 1) un approccio a livello nucleare per l'identificazione specie-specifica del Beluga basato sulla presenza di uno SNP diagnostico identificato all’interno dell’introne del gene codificante per la proteina ribosomiale S7 (RP2S7); 2) un pannello di loci microsatellite sviluppato per effettuare analisi di parentela. Il marcatore RP2S7 identificato, grazie alla sua elevata efficienza e semplicità dovute alla metodologia diagnostica a singolo locus tramite una rapida identificazione di un prodotto di PCR su gel di agarosio, risulta essere altamente affidabile in caso di controlli di routine per il Beluga. Il marcatore RP2S7 inoltre, unitamente all’utilizzo di primer specie-specifici per differenti specie di storione precedentemente identificati sul locus RP1S7, garantisce l’identificazione di numerosi ibridi che includono il Beluga sia come specie materna che paterna. Il pannello di loci microsatellite identificato risulterà inoltre utile per effettuare analisi di parentela tra gli individui presenti negli impianti di acquacoltura del territorio italiano, i quali costituiscono una possibile fonte per la selezione di potenziali riproduttori. Il presente studio ha consentito per la prima volta di delineare il pattern di variabilità genetica tra le diverse popolazione dell’intero areale di distribuzione del Beluga. Per quanto riguarda il confronto dei campioni museali Adriatici, le poche informazioni ottenute non hanno permesso di allocare con certezza tali individui a uno dei principali bacini. Per questo motivo l’identificazione di una popolazione sorgente ideale non può essere unicamente basata su informazioni di tipo genetico, ma deve piuttosto tenere conto di differenti fattori, come la prossimità geografica o la similarità ecologica. In ogni caso il livello di differenziamento genetico osservato fra bacini pone le basi per evitare il mescolamento di individui appartenenti ai due diversi bacini principali negli stock riproduttivi in cattività, prudente strategia per evitare outbreeding. Per quanto riguarda la reintroduzione del Beluga nell’area dell’Adriatico, la necessità di un’attenta analisi genetica di tutti gli individui che verranno impiegati nei futuri piani di rilascio è un chiaro risultato del presente lavoro. La disponibilità di tecniche genetiche per l’accertamento della purezza della specie e per le analisi di parentela getta le basi per una corretta gestione di questa specie in pericolo critico nel territorio italiano.