Natural Polymer X (NPX): A Novel Adjuvant For Protein-based Vaccination Strategies

The emerging popularity of subunit vaccines that are constituted by poorly immunogenic synthetic and recombinant antigens, has underlined the importance of discovering new and potent adjuvants able to modulate, enhance, and extend the immune response against these antigens. Many different classes of adjuvants are currently under development in pre-clinical or clinical stage, but only a few are licensed for clinical use. The class of natural polymers (NPs) is emerging as a promising alternative among adjuvant formulations; thanks to their chemical and physical properties and their potential for functionalization, natural polymers can be rationally modified to improve their adjuvanticity and to elicit an optimal immune response, making them attractive candidates for substituting conventional adjuvants. Natural polymer X (NPX) is a biodegradable, biocompatible, non-toxic, and non-inflammatory linear polysaccharide, which can be easily conjugated to virtually all types of antigens. Moreover, low molecular weight (LMW) NPX derivatives behave as a damage-associated molecular pattern (DAMP) molecules, acting as Toll-Like Receptor (TLR) agonists. This project aimed at exploring the potentiality of NPX as an effective and safe adjuvant for protein-based vaccination studies. To this end, the ovalbumin (OVA) model antigen was chemically linked to NPX, and the resulting NPX-OVA bioconjugate was used for mice immunization. Different vaccination schedules, concentrations of the conjugated antigen, and molecular weights of NPX were tested, and induction of humoral response was evaluated by ELISA. Overall, results showed that NPX conjugation to the model antigen is able to strongly increase OVA immunogenicity, exerting a remarkable adjuvant effect. Indeed, our data demonstrated the superiority of NPX adjuvant over Alum, since NPX is efficient in inducing potent and long-lasting humoral responses that, differently from those obtained with Alum, are characterized also by the production of IgG2a and IgG2b subclasses. NPX conjugation to OVA was also showed to allow antigen and dose sparing, since OVA-specific IgGs were detected already after a single injection of NPX-OVA and also following immunization with very low antigen doses. Moreover, NPX was compared with other commercial adjuvants (Quil-A, Addavax, Complete/Incomplete Freund’s Adjuvant (CFA/IFA), Chitosan, LPS, and Montanide), showing to induce an IgG production that is comparable or even superior to that produced by all the tested adjuvants. Only CFA/IFA-induced humoral response was higher than that generated with NPX-OVA, but NPX was always more efficient than other adjuvants already approved for clinical use (e.g. Alum, Addavax). Experiments aimed at dissecting the capability of NPX of inducing a cellular immune response showed controversial results. Although immunization of mice with NPX-OVA proved to induce cytotoxic responses that were comparable to those induced by well-known Th1-inducing adjuvants, no significantly higher numbers of SIINFEKL-specific CD8+ cells were detected by pentamer staining in different compartments following NPX-OVA immunization. Thus, the question whether NPX is also able to promote cytotoxic immune responses, or whether its adjuvanticity prevalently reside on its ability to generate a very potent and long-lasting humoral response, remains still open. In this work, another remarkable feature of NPX as adjuvant was highlighted: its biocompatibility at injection site and its generally safe profile. Results obtained by cell recruitment and cytokines analysis in muscles overall indicate that NPX is extremely safe and well tolerated when injected i.m., apparently acting differently from classical immunological adjuvants that trigger strong inflammatory responses at the site of injection. In vivo biodistribution studies confirmed by fluorescence microscopy analysis, indicated that NPX promotes the rapid migration of the antigen to the draining lymph node, thus inducing the accumulation of the antigen where the encounter with APCs is facilitated. In parallel, experiments performed in vitro confirmed that NPX-OVA can be digested by the enzyme NPXase, leading to the production of LMW fragments of NPX that are described in literature to act as TLRs agonists, and induce DCs maturation. This was confirmed by in vitro experiments, which demonstrated that stimulation with LMW NPX derivatives is able to activate bone marrow-derived dendritic cells (BMDCs). Thus, with regards of NPX mechanism of action, we hypothesize a potential scenario where NPX is responsible for the rapid drainage of the antigen to the lymph node, where it is preferentially accumulated. Simultaneously, NPX may undergo degradation by NPXase enzymes present in tissues. LMW NPX products generated from NPX digestion may function as DAMPs activating DCs trough binding specific TLRs and thus stimulating antigen recognition and presentation to effector cells. Taken together, this work proposes NPX as a new and promising candidate adjuvant, offering insight into its major adjuvant features and its mechanism of action, and demonstrating its efficacy and tolerability in preclinical animal models. NPX was indeed showed to be extremely well biotolerated in vivo, and to induce robust and long-lasting humoral immune responses, leading to improved results as compared to other clinical-grade adjuvants; moreover, it was efficient with strongly reduced antigen concentrations and number of injections. In summary, our data demonstrate that NPX is a powerful and safe natural adjuvant, which could be exploited for the design of new and efficient protein-based vaccine formulations.

L'emergente popolarità di vaccini a subunità costituititi da antigeni sintetici e ricombinanti scarsamente immunogenici, ha sottolineato l’importanza della scoperta di nuovi e potenti adiuvanti capaci di modulare, aumentare ed estendere nel tempo la risposta immunitaria contro tali antigeni. Numerose classi di adiuvanti sono attualmente in fase di sviluppo pre-clinico e clinico, ma solo pochi sono ad oggi hanno ottenuto l’autorizzazione per l'uso clinico nell’uomo. La classe dei polimeri naturali sta emergendo come un'alternativa promettente tra le formulazioni di adiuvanti; grazie alla loro composizione chimica, alle proprietà fisiche e al loro potenziale di funzionalizzazione, i polimeri naturali possono essere, infatti, modificati per incrementare la loro adiuvanticità e indurre una risposta immunitaria ottimale, rendendoli dei validi candidati per la sostituzione dei convenzionali adiuvanti attualmente in uso. Il polimero naturale X (NPX) è un polisaccaride lineare biodegradabile, biocompatibile, non tossico e non infiammatorio che può essere facilmente coniugato a tutti i tipi di antigeni proteici. Inoltre, derivati a basso peso molecolare di NPX si comportano come profili molecolari associati al danno (DAMPs), agendo da agonisti dei recettori Toll-like (TLRs). Questo progetto mira ad identificare le potenzialità di NPX come adiuvante efficace e sicuro da applicare a studi di vaccinazione basati su antigeni proteici. A tal fine, l’antigene modello ovalbumina (OVA) è stato legato covalentemente a NPX, generando il bioconiugato NPX-OVA che è stato utilizzato in esperimenti di immunizzazione in vivo su topo. Diverse strategie di vaccinazione, concentrazioni di antigene coniugato e pesi molecolari di NPX sono stati testati, inoltre è stata valutata l'induzione della risposta umorale mediante test ELISA. Nel complesso, i risultati hanno dimostrato come la coniugazione di NPX con l’antigene modello sia in grado di accrescere fortemente l’immunogenicità dell’OVA, esercitando un notevole effetto adiuvante. I dati ottenuti evidenziano infatti la superiorità dell’adiuvante NPX nei confronti dell’allume, dal momento che NPX è in grado di indurre risposte umorali potenti e durature, che, a differenza di quelle indotte dall’allume, sono caratterizzate anche dalla produzione delle sottoclassi anticorpali IgG2a e IgG2b. Inoltre, è stato dimostrato che la coniugazione di NPX all’OVA consente sia la riduzione del numero di dosi di inoculo che la riduzione della quantità di antigene da utilizzare, dal momento che IgG specifiche per OVA sono state rilevate già dopo una singola iniezione di NPX-OVA e anche a seguito ad immunizzazioni effettuate con dosi molto basse di antigene. In questo lavoro, NPX è stato anche confrontato con altri adiuvanti commerciali (Quil-A, Addavax, adiuvante di Freund completo/incompleto (CFA/IFA), Chitosano, LPS, e Montanide), mostrandosi in grado di indurre una produzione di IgG paragonabile o addirittura superiore a quella prodotta dagli altri adiuvanti testati. Solo la risposta umorale indotta dal CFA/IFA è risultata superiore a quella generata da NPX-OVA, il quale però è risultato sempre più efficiente dei due adiuvanti già approvati per l'uso clinico (allume e Addavax). Esperimenti volti ad analizzare la capacità di NPX di indurre una risposta immunitaria cellulare, hanno portato a risultati controversi. È stato dimostrato che la vaccinazione di topi con NPX-OVA è in grado di indurre risposte citotossiche comparabili a quelle scatenate da adiuvanti noti per la loro capacità di produrre un risposta prevalentemente Th1; tuttavia, la marcatura con il pentamero specifico per il peptide di OVA (SIINFEKL) di cellule di milza, linfonodo e sangue prelevati da topi immunizzati con NPX-OVA, non ha evidenziato quantità misurabili di linfociti CD8+ specifici per SIIKFEKL. Rimane perciò da chiarire se NPX sia in grado di indurre anche risposte citotossiche o se la sua adiuvanticità risieda prevalentemente o unicamente nella capacità di generare risposte umorali potenti e di lunga durata. In questo studio è stata messa in evidenza anche un’altra caratteristica estremamente importante di NPX: la sua biocompatibilità al sito di inoculo e, in generale, il suo profilo di sicurezza. Risultati ottenuti da studi di reclutamento di cellule e analisi di citochine nel muscolo di topo in seguito a vaccinazione hanno evidenziato che NPX è estremamente sicuro e ben tollerato quando inoculato per via intramuscolare, suggerendo che esso agisca apparentemente in modo diverso rispetto agli adiuvanti immunologici classici che innescano forti reazioni infiammatorie nel sito di inoculo. Esperimenti di biodistribuzione in vivo, confermati mediante microscopia a fluorescenza, suggeriscono che NPX promuova la rapida migrazione dell'antigene ai linfonodi drenanti, favorendone l‘accumulo, dove è facilitato l'incontro con le cellule presentati l’antigene. In parallelo, esperimenti condotti in vitro hanno confermato che il bioconiugato NPX-OVA può essere digerito dall'enzima NPXase, producendo frammenti di NPX a basso peso molecolare che da letteratura possono agire come agonisti TLR, e indurre la maturazione di cellule dendritiche (DCs). Ciò è stato confermato da esperimenti in vitro che hanno mostrato come la stimolazione con derivati di NPX a basso peso molecolare sia in grado di attivare le DCs derivate da midollo osseo murino. Questi risultati consentono di ipotizzare un potenziale scenario che identifica il meccanismo di azione in cui NPX agisce favorendo il rapido drenaggio e un preferenziale accumulo dell'antigene nel linfonodo. Allo stesso tempo, NPX potrebbe andare incontro a degradazione da parte degli enzimi NPXasi presenti nei tessuti; i frammenti a basso peso molecolare, generati da questa digestione, potrebbero funzionare come DAMPs, attivando le DCs in seguito al legame con i recettori TLR, stimolando così il riconoscimento e presentazione dell'antigene alle cellule effettrici. Nel complesso, questa tesi identifica NPX come candidato ad essere un nuovo e promettente adiuvante agonista dei TLR, in base alle evidenze sulle sue principali caratteristiche di indurre sia una risposta umorale che citotossica e al meccanismo d'azione, dimostrando, infine, l'efficacia e la tollerabilità in modelli preclinici. I dati ottenuti dimostrano che NPX è un adiuvante naturale, potente e sicuro, che potrebbe essere sfruttato per la progettazione di nuove ed efficienti formulazioni di vaccini a base proteica.