The Photoexcited Triplet State as a Spin Probe for Distance Determination in Pulse EPR Dipolar Spectroscopy

The biological function of macromolecules such as protein, DNA, and RNA depends on their folding and on the relative movements of domains with dimensions of a few nanometers. This length scale can be accessed by distance measurements between paramagnetic spin centers employing Electron Paramagnetic Resonance (EPR) pulsed dipolar spectroscopy (PDS) techniques. In order to use this spectroscopic methods, the biomolecule has to contain either stable or transient paramagnetic centers, which can be metal ions or clusters, amino acid radicals, or organic cofactor radicals. If the biomolecule is diamagnetic, it can be spin-labeled with nitroxides or a diamagnetic metal may be substituted with a paramagnetic one. Nitroxides are the most employed spin probes in PDS, especially for structural studies in proteins were they can be attached to specific sites following a protocol of mutagenesis and site-directed spin labeling (SDSL) on cysteine residues. However, the introduction of a spin label can modify the structure around the labeling site and in some regions it may even interfere with the correct folding. For this reason, exploiting endogenous probes i.e. paramagnetic centers which are naturally present in the protein, represents an primary task in PDS. Indeed, PSD has been entatively performed on various classes of proteins naturally containing metal base-prosthetic groups such as and low-spin ferric heme centers, iron-sulfur cluster, Mn clusters for which mainly the ¢mS Æ §1/2 transition can be selected. Utilizing endogenous probes for EPR detection only causes minimal functional perturbation to the macromolecules. Another advantage is that they are firmly anchored in the protein and, therefore, are not fraught with the problem of flexible linkers as the commonly used spin labels. In recent years photoexcited triplet state of porphyrin has been introduced in the selection of spin labels for PDS applications. In their ground state, these chromophores are diamagnetic and thus EPR-silent, but, upon laser photoexcitation, their triplet state can be populated via intersystem crossing from the lowest excited singlet state, generating in this way the paramagnetic center. The inter-system crossing mechanism makes the population of the triplet sublevels different from the Boltzmann distribution, significantly enhancing the intensity of their EPR signals. Moreover porphyrin-derivative groups are suitable to be exploited as endogenous probes because are present in numerous systems such as heme-protein and photosynthetic proteins. The orthogonal labeling method, based on the use of spectroscopically nonidentical labels which can be addressed selectively in the EPR experiment, is attracting increasing interest in the spectroscopic community. Triplet states work very efficiently as orthogonal labels, adding to the spectroscopic selectivity the advantage of behaving as photoinduced spin probes. This feature allows to perform PDS in the presence of light excitation to measure intramolecular triplet-nitroxide distances or in the absence of light excitation revealing intermolecular nitroxide-nitroxide interactions. While the feasibility of the PDS experiment had already been demonstrated for a photoexcited porphyrin moiety interacting with a nitroxide radical [Di Valentin, M.; Albertini, M.; Zurlo, E.; Gobbo, M. and Carbonera, D. J. Am. Chem. Soc., 2014, 136, 6582 -6585], the accuracy of the new labeling approach for distance determination, and the theoretical frame describing the behavior of polarized high-spin systems for application in dipolar techniques were still laking. In this thesis work a complete spectroscopic and theoretical characterization of photoexcited triplet state probes has been carried out. The reliability and versatility of such spin labels has been tested employing different dipolar pulse schemes and exploiting diverse chromophores for the photogeneration of the paramagnetic center, both in peptide-based model systems and in protein belonging to different classes. The study has been completed with an exhaustive theoretical description. The reliability and the accuracy of the new labeling approach has been demonstrated by measuring the dipolar traces of a spectroscopic ruler composed by a-helix peptides of increasing length, labeled with a porphyrin chromophore, that upon photoexcitation gives the EPR-active species, and a nitroxide artificial amino acid. The good correlation between the distances obtained by experimental PDS data and calculation, is used to asses the accuracy of the new labeling approach. In PDS, there are different pulse sequences that exploits diverse mechanisms to induce the dipolar oscillations. Such pulse schemes have been tested on the triplet state in order to classify the performances of the various PDS techniques with the novel labeling approach. The availability of different light-induced PDS sequences increases the versatility of triplet state probes allowing to select case by case the pulse scheme that guarantees the best signal-to-noise ratio. The new labeling approach has been extended to two paradigmatic proteins: the light-harvesting complex Peridinin-Chlorophyll a-Protein fromAmphidinium Cartarae and the human Neuroglobin belonging to the globins family where the endogenous prosthetic groups have been exploited to photo-generated the triplet state. In the photosynthetic protein the dipolar trace arising from the interaction between the triplet state of one of the carotenoids in the photoactive site and a nitroxide, introduced via site-directed spin labeling, have been measured. This allowed to identify the pigment involved in the photoprotective mechanism and demonstrated that, not only porphyrin-derivatives, but also other chromophores can be used as spin probes. In human neuroglobin the Zn-substitution of the heme has allowed to populate the triplet state of the Zn protoporphyrin IX and successfully measure the dipolar trace proving the applicability of this labeling procedure on the class of hemeproteins. The full characterization of triplet state probes has been completed with a theoretical study based on the density matrix formalism. First, the analytic formula describing the modulation of the dipolar trace for a simplified radical-triplet state system has been obtained, highlighting a time an analogous dependence to the radical-radical case. Subsequently, a program for time-domain numerical calculation of radical-triplet state dipolar traces has been implemented and employed for a quantitative characterization of triplet state probes in PDS.

Il ruolo di molte macromolecole di interesse biologico come ad esempio proteine ed acidi nucleici, dipende dalla loro struttura tridimensionale e da movimenti di domini dell’ordine di pochi nanometri. La spettroscopia paramagnetica elettronica (EPR) ed in particolare le tecniche di spettroscopia impulsata dipolare (PDS) costituiscono lo strumento ideale per studiare sistemi di quest’ordine di grandezza. Tuttavia, per poter utilizzare tecniche PDS nella caratterizzazione di bio-macromolecole, queste devono contenere centri paramagnetici come ad esempio ioni o cluster metallici, oppure centri radicalici. Nel caso in cui il sistema sia diamagnetico è necessario quindi inserire delle sonde paramagnetiche o sostituire eventuali metalli diamagnetici con altri metalli EPR-attivi. I radicali nitrossidi sono le sonde di spin più comunemente impiegate nella spettroscopia dipolare, soprattutto per studi in proteina in cui, per introdurre di tali sonde, è possibile seguire un protocollo di mutagenesi sito-specifica seguita da spin labeling diretto alle cisteine. L’inserimento di sonde di spin tuttavia può causare forti modifiche strutturali alla macromolecola o addirittura interferire con il suo corretto folding. Per questo motivo, quando possibile si tenta di sfruttare centri paramagnetici che siano naturalmente presenti in proteina. Sono stati infatti effettuati diversi studi di spettroscopia dipolare in metallo-proteine sfruttando la transizione ¢mS Æ §1/2 del gruppo prostetico contenente il centro metallico. L’utilizzo di tali gruppi prostetici non causa alcuna alterazione strutturale alla molecola, inoltre, diversamente da molte sonde endogene, questi sono strettamente ancorati all’intorno proteico e forniscono quindi informazioni strutturali più accurate. La porfirina in stato di tripletto fotoeccitato è stata di recente introdotta tra la collezione di sonde di spin utilizzabili nelle tecniche PDS. Nel loro stato fondamentale le porfirine sono diamagnetiche e pertanto EPR silenti, ma in seguito a fotoeccitazione laser possono popolare tramite inter-system crossing lo stato di tripletto eccitato a più bassa energia, divetando in tal modo EPR-attive. Il popolamento tramite inter-system crossing fa si che la popolazione dei sottolivelli di tripletto devii dalla distribuzione di Boltzmann, aumentando enormemente l’intensità del segnale EPR di tale specie che vengono per questo motivo definite "polarizzate". Inoltre derivati porfirinici sono presenti in numerosi sistemi naturali, come ad esempio le emoproteine o le proteine conivolte in processi fotosintetici, e ciò li rende particolarmente interessanti per l’utilizzo in spettroscopia dipolare in quanto possono essere sfruttati come sonde endogene. Il labeling ortogonale, basato sull’impiego di sonde di spin spettroscopicalmente distinte che possono essere eccitate selettivamente durante un esperimento EPR, rappresenta un approccio particolarmente vantaggioso nelle tecniche PDS. Gli stati di tripletto fotoeccitato hanno un valore aggiunto come sonde ortogonali perchè aggiungono alla selezione spettrale il fatto di essere sonde foto-indotte. Questa caratteristica fa si che sia possibile misurare distanze intarmolecolari tripletto-nitrossido, applicando la fotoeccitazione laser, e distanze ntermolecolari nitrossido-nitrossido spegnedo invece la fotoeccitazione. Mentre la fattibilità di esperimenti di spettroscopia dipolare applicati a stati di tripletto fotoeccitati era già stata dimostrata precedentemente a questo lavoro di tesi [Di Valentin, M.; Albertini, M.; Zurlo, E.; Gobbo, M. and Carbonera, D. J. Am. Chem. Soc., 2014, 136, 6582 -6585], mancavano completemente indagini in grado di stabilire l’affidabilità e l’accuratezza del nuovo sistema di labeling e un inquadramento teorico in grado di escrivere il comportamento di tali sistemi polarizzati ad alto spin durante l’esperimento PDS. Il lavoro alla base della presente tesi è consistito nella completa caratterizzazione spettroscopica e teorica di questi sistemi di spin. Per verificare l’affidabilità del nuovo approccio, le sonde di tripletto sono state testate con diverse tecniche PDS, e sono stati inoltre utilizzati vari cromofori per la foto-generazione del centro paramagnetico, effettuando l’analisi sia su sistemi modello che in proteina. Lo studio è stato completato con un esaustivo trattamento teorico dei sistemi tripletto-radicale in spettroscopia dipolare. La precisione e l’accuratezza del metodo sono state verificate misurando le tracce dipolari di un righello spettroscopico costituito da una serie di perptidi in ®-elica di lunghezza crescente, ognuno marcato con un cromoforo porfirinico e un radicale nitrossido. L’ottima correlazione trovata tra le distanze ottenute analizzando le tracce sperimentali e i dati strutturali derivanti dai calcoli ha permesso di dimostrare l’affidabilità delle sonde di tripletto nelle tecniche PDS. Attualmente sono disponibili diverse sequenze PDS che sfruttano diversi meccanismi per indurre l’oscillazione dipolare nelle tracce sperimentali. Molte di queste sequenze sono state quindi testate sulla sonda di tripletto in modo da verificarne le prestazioni con le diverse tecniche. La disponibilità di molteplici sequenze PDS e il loro buon funzionamento su sistemi fotoindotti permette di selezionare, a seconda dei casi, lo schema di impulsi che garantisce le migliori prestazioni in termini di rapporto segnale-rumore e ciò dimostra la versitilità delle sonde di tripletto. La nuova metodologia è stata estesa anche a studi in proteina utilizzando come sistemi modello la Peridinin-Chlorophyill a-Protein, appartenente alla classe delle proteine fotosintetiche, e neuroglobina umana, facente parte della famiglia dellle globine. In Peridinin-Chlorophyill a-Protein è stata misurata l’interazione dipolare tra uno dei carotenoidi presenti nel sito attivo e un nitrossido inserito tramite spin labeling, permettendo non solo l’individuazione del pigmento coinvolto nel meccanismo di fotoprotezione, ma espendendo anche l’applicabilità dell’esperimento a cromofori diversi dai derivati porfirinici. Nella neuroglobina umana invece la zinco-sostituzione dell’eme ha permesso di popolare lo stato di tripletto nel gruppo endogeno e dimostrando che la tecnica dipolare fotoindotta può essere utilizzata anche nello studio strutturale di proteine (macromolecole) apparteneneti alla classe delle emoproteine. Infine è stata effettuata anche un’esaustiva caratterizzazione teorica delle sonde di tripletto basata sul formalismo della matrice densità. E’ stata ricavata l’espressione che descrive la modulazione delle tracce dipolari in sistemi tripletto-radicale, che è risultata essere analoga a quella ottenuta per sistemi di due radicali interagenti. Successivamente è stato implementato un programma per il calcolo numerico di tracce dipolari che ha permesso una descrizione quantitativa diversi sistemi tripletto-radicale.