Breeding in European sea bass (Dicentrarchus labrax L.): genetic aspects of resistance to VNN and sex determination, and development of genomic prediction tools

During the recent years, the amount of fish for human consumption provided by aquaculture has impressively increased, and this led to a growing attention towards the development and the improvement of production techniques, including selective breeding programs, that are seen as principal drivers in the improvement of production traits (growth, morphology) and efficiency traits (processing yield, feed efficiency, product quality and disease resistance) of the farmed species. Disease outbreaks in aquaculture may have severe consequences, interfering with the progress and sustainability of the farm and causing huge production and economic losses. For these reasons, the interest towards the genetic improvement of disease resistance has significantly increased, thanks to the availability of new and more advanced genomic tools and techniques, the development of genome-wide sequencing and genotyping technologies and the generation of high-density marker data. In aquaculture species, selective breeding with the aim to establish disease resistant lines is an effective approach, in particular for those viral and bacterial infections that are not treatable with chemotherapeutics and antibiotics or for which vaccines are not currently available on a commercial scale. Selective breeding allows a long-term control of the disease and a cumulative and permanent improvement of the trait over generation at the population level. Betanodaviruses (nervous necrosis viruses, NNV) cause one of the major and severe infections (viral nervous necrosis, VNN) in more than 50 fish species, including the European sea bass (Dicentrarchus labrax L.). The effects of VNN outbreaks in sea bass hatcheries and farms are serious, with mortality rates up to 100% in the larval and juvenile stages. The first aim of the project was to estimate the genetic and genomic parameters for VNN resistance traits. A sea bass experimental population derived from a commercial breeding stock (N = 650) was subjected to a VNN challenge test and a genome-wide SNP dataset for sea bass was generated through a high-throughput sequencing approach (2b-RAD). Estimates of heritability for mortality as a binary trait (0/1) and survival time were moderate or low (genetic h2mort = 0.14-0.23, genomic h2mort = 0.06; genetic h2surv = 0.07-0.14, genomic h2surv = 0.03). Due to the possible application of indirect approaches to improve VNN resistance, we investigated the variation in a physiological parameter (post-stress cortisol concentration) and an immunological parameter (antibody titer to NNV) to determine the additive genetic variation of these traits, and the genetic correlation with disease resistance. Both traits showed a significant genetic and genomic variability (genetic h2HC = 0.19-0.23, genomic h2HC = 0.19; genetic h2AT = 0.28-0.39, genomic h2AT = 0.26). Cortisol concentration showed a null genetic correlation with VNN mortality, while the genetic relationship between antibody titer and mortality was negative (ra mort/AT = -0.39). The genetic and genomic heritability estimates for body weight (548 d post-hatching) were confirmed high (genetic h2BW = 0.45-0.60, genomic h2BW = 0.45); moreover, body weight was positively genetically correlated with cortisol concentrations and antibody titer (ra BW/HC = 0.12 and ra BW/AT = 0.49), while negatively correlated with mortality (ra BW/mort = -0.39). The second aim of the project was to investigate the potential and the effectiveness of genomic tools in predicting the genetic merit for the traits of concern. Five Bayesian models (BayesA, BayesB, BayesC, Bayesian LASSO, Bayesian Ridge Regression) were compared and their accuracy (in terms of correlation between observed value and prediction) when predicting the phenotype or the EBV (estimated breeding value) for VNN mortality, post-stress cortisol concentrations, antibody titer or body weight was estimated, without observing any differences between the five models. The prediction accuracy of the EBV for VNN mortality reached values equal to 0.89; the prediction accuracies of the EBV and the phenotype for post-stress cortisol concentration were 0.88 and 0.22, respectively, for antibody titer 0.76 and 0.26, respectively, and for body weight 0.69 and 0.39, respectively. Different metrics (the area under the ROC curve, the proportion of true results among the total number of samples, the Matthew’s correlation coefficient) were employed to evaluate the classification performance of prediction of the EBV for VNN mortality when used to classify the phenotype for the same trait, resulting in better classification performance, as measured by the AUC metric, in comparison with the classification based on genomic predictions of the phenotype. Overall, the results indicate that genomic prediction could have a great potential for traits like VNN mortality, body weight, cortisol concentration and antibody titer in European sea bass, leading to the reduction of the need of routine phenotyping and outperform traditional approaches in the enhancement of disease resistance, although further investigations on a larger experimental population are needed. Moreover, further studies should elucidate the effects of the method of infection used in challenge tests (immersion or injection) on the variation in the infection response observed and genetic parameters thereof. The third part of the project addressed the genetic architecture of sex determination in European sea bass. Sea bass sex determination model is complex and consistent with a polygenic model, where phenotypic sex is determined by the sum of small individual gene effects, but it is significantly affected by environmental temperature, as well. The comprehension of the genetic architecture of sex tendency in sea bass could be interesting even in the context of aquaculture. Actually, the strong bias towards males under aquaculture conditions has been recognised by farmers as problematic for different reasons (lower growth rates of males compared to females, reduced flesh quality and general decrease of the commercial values of the product). Because polygenic sex determination is considered evolutionarily unstable, the genetic architecture could be different in populations belonging to various geographical areas and exposed to different environmental/thermal conditions. Experimental progeny crosses (N = 927) were produced using wild dams from the Western Mediterranean and wild sires from four geographical areas (North Atlantic, Western Mediterranean, North-Eastern Mediterranean, South-Eastern Mediterranean), consistent with the natural range of the species in North Atlantic and Mediterranean Sea and characterized by different environmental conditions. The sex-ratio was strongly skewed towards males both in the global dataset and within each paternal group, with significant variation among populations, dams and sires. Sex, body weight and body length showed moderate heritability (h2sex =0.52 ± 0.17, h2BW =0.46 ± 0.17, h2BL = 0.34 ± 0.15) and sex tendency was genetically correlated with body weight and length (ra sex/BW = 0.69 ± 0.12, ra sex/BL = 0.66 ± 0.13). A weighted genome-wide association study (wGWAS) performed both on the global dataset and within each paternal group revealed a different genetic architecture of sex determination between Atlantic and Mediterranean populations, with a more similar genetic architecture among geographically close populations compared to geographically distant populations, consistent with the hypothesis of a population-specific evolution of the polygenic sex determination system in different environments.

Negli ultimi anni la richiesta di prodotti derivanti dall’acquacoltura è aumentata considerevolmente, comportando una maggiore attenzione volta allo sviluppo ed al miglioramento delle tecniche di produzione, compresi programmi di selezione genetica volti al miglioramento di caratteri produttivi (peso, morfologia) e di efficienza delle specie allevate (resa produttiva, efficienza alimentare, qualità del prodotto, resistenza alle malattie). In particolare, la comparsa di infezioni virali e batteriche in avannotteria ed in allevamento, può avere gravi conseguenze, sia in termini economici e produttivi, sia dal punto di vista del progresso e della sostenibilità dell’allevamento stesso. Per questo motivo, l’interesse verso il miglioramento genetico della resistenza alle malattie in specie ittiche è notevolmente aumentato, anche grazie al costante progresso di strumenti e tecniche di biologia molecolare che consentono la genotipizzazione e la generazione di panel di marcatori genome-wide. La selezione per produrre lotti di animali geneticamente migliorati risulta una strategia particolarmente efficace e di specifico interesse per patologie virali o batteriche per le quali le comuni misure di gestione come farmaci ed antibiotici non sono contemplate, presentano scarsa efficacia, o come i vaccini, risultano essere al momento soltanto in fase di sviluppo sperimentale. La selezione genetica per la resistenza alle malattie consente invece un controllo a lungo termine della patologia attraverso un cambiamento permanente delle caratteristiche genetiche degli animali che può essere trasmesso di generazione in generazione. L’encefalopatia e retinopatia virale (o viral nervous necrosis, VNN) è una delle maggiori e più gravi patologie riscontrata in più di 50 specie ittiche, tra cui il branzino (Dicentrarchus labrax L.). Le conseguenze di focolai di VNN in branzino sono decisamente significative, con tassi di mortalità fino al 100% negli stadi larvali e giovanili. Il primo obiettivo del progetto è stato quello di valutare i parametri genetici e genomici per i caratteri di resistenza a VNN. 650 animali prodotti in un allevamento commerciale sono stati quindi sottoposti ad infezione sperimentale con Betanodavirus (nervous necrosis virus, NNV) ed è stato prodotto un dataset di marcatori genome-wide (SNP) mediante approcci di sequenziamento high-throughput (tecnica 2b-RAD). L’ereditabilità per la mortalità intesa come carattere binario (0/1) o come tempo di sopravvivenza ha mostrato valori moderati o lievi (genetica: h2mort = 0,14-0,23, h2surv = 0,07-0,14; genomica: h2mort = 0,06, h2surv = 0,03). Visto l’interesse verso possibili indicatori da utilizzare come criteri di selezione indiretta, sono stati studiati anche parametri fisiologici (livello di cortisolo ematico post-stress) ed immunitari (titolo anticorpale a Betanodavirus) con lo scopo di determinarne la variabilità genetica additiva e la correlazione genetica con i caratteri di resistenza a Betanodavirus. Entrambi i parametri hanno mostrato valori di ereditabilità genetica e genomica interessanti (genetica: h2HC = 0,19-0,23, h2AT = 0.28-0.39, genomica: h2HC = 0,19, h2AT = 0,26). La correlazione genetica tra concentrazione di cortisolo e probabilità di morte è risultata nulla, mentre quella tra titolo anticorpale e probabilità di morte è risultata negativa (ra mort/AT = -0,39). L’ereditabilità genetica e genomica per il peso (548 giorni post-hatching) si è confermata elevata (genetica: h2BW = 0,45-0,60; genomica: h2BW = 0,45); il peso, inoltre, è risultato positivamente correlato dal punto vista genetico ai livelli di cortisolo ed al titolo anticorpale (ra BW/HC = 0,12 e ra BW/AT = 0,49), mentre la correlazione genetica tra questo carattere e la mortalità è risultata negativa (ra BW/mort = -0,39). Il secondo obiettivo del progetto è stato quello di investigare il potenziale predittivo di strumenti genomici per i caratteri considerati. Sono stati confrontati cinque modelli Bayesiani (BayesA, BayesB, BayesC, Bayesian LASSO, Bayesian Ridge Regression) e ne è stata stimata l’accuratezza (in termini di correlazione tra valori osservati e predetti) quando i modelli sono stati utilizzati per predire il fenotipo o l’EBV (estimated breeding value) per mortalità a VNN, livelli di cortisolo, titolo anticorpale o peso, senza però osservare differenze significative tra i modelli. L’accuratezza nel predire gli EBV per la mortalità ha raggiunto valori di 0,89; l’accuratezza nel predire gli EBV ed il fenotipo per i livelli di cortisolo è risultata 0,88 e 0,22, rispettivamente, per il titolo anticorpale 0,76 e 0,26, rispettivamente, per il peso 0,69 e 0,39, rispettivamente. Diverse metriche (area sottesa alla curva ROC, proporzione di risultati corretti sul numero totale di casi, coefficiente di correlazione di Matthew) sono state impiegate per valutare le performance di predizione degli EBV per la mortalità con lo scopo di classificare il fenotipo del carattere stesso, risultando in una migliore performance di classificazione, come indicato dalla metrica AUC, rispetto alla classificazione basata sulle predizioni genomiche del fenotipo. Nel complesso, questi risultati indicano che la predizione genomica potrebbe avere un enorme potenziale per caratteri come la mortalità dovuta a VNN, peso, concentrazione di cortisolo e titolo anticorpale in branzino, utile anche per ridurre la necessità di raccolte periodiche di dati fenotipici e fornendo migliori risultati rispetto agli approcci tradizionali per il miglioramento della resistenza alle patologie. Studi ulteriori su un maggior numero di animali sono comunque indispensabili, così come un approfondimento sulle variazioni nella risposta all’infezione, e quindi nei parametri genetici, dovute ai diversi metodi di infezione usati nei challenge test (immersione, iniezione). Il terzo obiettivo di questo progetto è stato invece rappresentato dallo studio dell’architettura genetica del meccanismo di determinazione del sesso in branzino. Il determinismo sessuale in branzino è un meccanismo poligenico complesso, in quanto risultato dell’interazione tra numerosi geni (con effetto limitato ma aventi azione uguale e cumulativa sul valore fenotipico) e temperatura ambientale. Capire i meccanismi genetici complessi che stanno alla base del determinismo sessuale è comunque interessante anche per una eventuale applicazione in acquacoltura, dal momento che l’alta percentuale di produzione di maschi rispetto alle femmine rappresenta un problema per diversi motivi (i maschi presentano precoce maturazione sessuale osservata in allevamento, con conseguente tasso di crescita inferiore, qualità inferiore del prodotto e, in generale, inferiore valore commerciale rispetto alle femmine). Partendo dal presupposto che un meccanismo di determinazione sessuale poligenico è evolutivamente instabile, l’architettura genetica potrebbe essere differente in popolazioni appartenenti a distinte aree geografiche caratterizzate da condizioni ambientali e termiche diverse. A questo scopo sono stati studiati 927 individui prodotti incrociando riproduttori femmine provenienti dalla zona Ovest del Mar Mediterraneo e riproduttori maschi provenienti da quattro diverse aree geografiche caratterizzate da condizioni ambientali differenti (Nord Atlantico, Ovest Mediterraneo, Nord-Est Mediterraneo e Sud-Est Mediterraneo) e corrispondenti alla distribuzione ed alla struttura genetica delle popolazioni naturali di branzino in Atlantico e Mar Mediterraneo. In generale, la percentuale di femmine nel dataset globale ed entro ciascun gruppo di diversa origine è sempre risultata inferiore rispetto alla percentuale di maschi, con differenze significative tra popolazioni, madri e padri. I valori di ereditabilità per sex tendency, peso e lunghezza (180 giorni post-hatching) sono risultati moderati (h2sex = 0,52 ± 0,17, h2BW = 0,46 ± 0,17, h2BL = 0,34 ± 0,15) e la sex tendency è risultata geneticamente correlata con peso e lunghezza, mostrando valori significativi (ra sex/BW = 0,69 ± 0,12, ra sex/BL = 0,66 ± 0,13). Uno studio di associazione (weighted GWAS) è stato effettuato sia sul dataset globale sia su ciascun gruppo di diversa origine con lo scopo di individuare marcatori SNP potenzialmente associati al determinismo sessuale. Lo studio ha rivelato una diversa architettura genetica per le popolazioni Atlantiche e Mediterranee, ma con affinità per individui appartenenti ad aree geografiche adiacenti, consistenti con l’ipotesi di evoluzione popolazione-specifica del meccanismo di determinazione sessuale in aree caratterizzate da condizioni ambientali differenti.