Apoplastic glutathione degradation by gamma-glutamyl transferase isoforms GGT1 and GGT2 is important for generative and vegetative development in Arabidopsis thaliana

Gamma-glutamyl transferase (GGT) is the unique enzyme able to degrade glutathione (GSH) in extra cytosolic spaces. In plant cell GGT1 and GGT2 isoforms are located in the apoplast, bound to the cell wall and to the plasma membrane respectively. GGT1 is expressed in whole plants mainly in leaves and in the vascular system, whereas more specific expression concerns GGT2 that is found in seed, trichome, pollen and weakly in root. However their role in plant physiology is still waiting to be defined. Glutathione, the substrate of GGT, is one of the most multifunctional molecule in biology, being the most important redox buffer and in plants one of the major source of reduced sulfur. Glutathione is a constituent of the phloem sap, but the mechanisms of its phloem loading and unloading are largely unknown. Obtaining and characterizing the ggt1/ggt2 RNAi double mutant allows to add more clues than the relative single mutants and to shutdown possible compensatory expression between the two isoforms. In this work the selection and characterization of previously obtained ggt1/ggt2 RNAi lines has been performed. The silencing level of both GGT1 and GGT2 transcript was verified by qRT-PCR and the total GGT activity analyzed. Furthermore phenotypic characterization was carried out; firstly, the GGT contribution in cysteine delivery to the seed and in seed development and composition was investigated. The ggt1/ggt2 RNAi plants showed lower seed yield due to reduced silique number and silique length. However thiol content and 2S albumin storage proteins did not change in mutant seeds. It can be concluded that GGT silencing results in metabolic readjustments leading to allocation of resources to less, but fully viable seeds. The fact that GGT uses GSH as a substrate poses the question whether altered resource allocation results from impairment of cysteine delivery to sink tissues and cells, or from redox imbalances which may result in altered glutathione metabolism. The latter might correlate with the observed proline accumulation, which suggests the occurrence of oxidative stress affecting also the germination rate, which resulted delayed. The vegetative growth was also slightly slowed down with a reduced growth rate of rosette diameter and root length. Trichomes, the leaf hair characterized by high level of GSH, were also less in number than wild-type. Moreover the GSH depletion by roots in ggt mutants suggests cooperation between the two isoforms. In conclusion the simultaneous GGT1 and GGT2 silencing induces the decrease of number of organs with high GSH demand (seed and trichome), oxidative stress in seeds and slightly affects vegetative growth. Further information about GGT will be provided by the double mutants obtained in this thesis work through the crossing between ggt mutants with sir1-1, that has reduced sulfur flux, and with ggct2;1, that lacks cytosolic GSH degradation.

La gamma-glutammil transferasi (GGT) è l’unico enzima in grado di degradare il glutatione (GSH) nelle regioni extra citosoliche. Le isoforme GGT1 e GGT2, nelle cellule vegetali, sono localizzate nell’apoplasto; ancorate rispettivamente alla parete cellulare e alla membrana plasmatica. La GGT1 è espressa in complesso in tutta la pianta, principalmente nelle foglie e nel sistema vascolare; mentre la GGT2 ha un’espressione più specifica e la si trova principalmente nei semi, nei tricomi, nel polline e in misura minore nelle radici. Tuttavia il loro ruolo nella fisiologia vegetale non è ancora stato chiarito. Il glutatione, substrato della GGT, è una delle molecole più versatili in biologia; infatti è tra i più importanti regolatori dello stato redox cellulare e nelle piante una delle principali fonti di zolfo ridotto. Il glutatione è un normale costituente della linfa nel floema, ma i meccanismi del suo caricamento e scaricamento floematico non sono ancora chiari. Ottenere e caratterizzare un doppio mutante ggt1/ggt2 RNAi permetterebbe di aggiungere più informazioni rispetto a quelle fornite dai singoli mutanti, evitando inoltre possibili meccanismi compensatori tra le due isoforme. In questo lavoro sono state selezionate e caratterizzate le linee ggt1/ggt2 RNAi, generate già in precedenza. Il livello di silenziamento di entrambi i trascritti GGT1 e GGT2 è stato verificato mediante qRT-PCR e l’attività totale della GGT è stata quantificata. Inoltre è stata condotta una caratterizzazione fenotipica; in primo luogo è stato studiato il contributo che potrebbe avere la GGT nel rilasciare cisteina al seme e in particolare la sua rilevanza nello sviluppo e nella composizione del seme. Le piante ggt1/ggt2 RNAi hanno mostrato una minore produzione di semi dovuta al ridotto numero di silique e della loro lunghezza. Tuttavia nessun cambiamento è stato riscontrato nel contenuto di tioli e nelle proteine di riserva albumina 2S dei semi mutanti. In conclusione il silenziamento della GGT induce un riaggiustamento metabolico che porta ad una redistribuzione delle risorse in un numero inferiore di semi, ma quanto meno vitali. Il fatto che la GGT usi il GSH come substrato solleva la questione sul fatto che l’alterata ridistribuzione delle risorse sia dovuto o a deficit nel rilasciare cisteina ai tessuti/cellule sink, o a scompensi redox che possono portare ad alterazioni nel metabolismo del glutatione. Quest’ultima possibilità potrebbe essere correlata con l’accumulo di prolina rilevato nei semi ggt1/ggt2 RNAi, suggerendo la presenza di uno stress ossidativo che va influenzare negativamente anche il tasso di germinazione, risultato ritardato. Anche la crescita vegetativa ggt1/ggt2 RNAi è risultata leggermente rallentata con una riduzione del diametro della rosetta e della lunghezza delle radici. I tricomi, i peli fogliari caratterizzati da alti livelli di GSH, erano anch’essi in numero minore rispetto al wild-type. Inoltre nei mutanti ggt il consumo di GSH da parte delle radici suggerisce una cooperazione tra le due isoforme. In conclusione il contemporaneo silenziamento di GGT1 e GGT2 induce una riduzione nel numero degli organi che hanno un’alta domanda di GSH (semi e tricomi), uno stress ossidativo nei semi e in misura minore influenza la crescita vegetativa. Nuove interessanti informazioni sulle GGT potranno essere estrapolate tramite lo studio dei doppi mutanti generati in questo lavoro, ottenuti incrociando i mutanti ggt con sir1-1, il quale ha un ridotto flusso di zolfo, o con ggct2;1, nel quale manca la degradazione citosolica del GSH.