Wnt pathway co-factors TCF1 and TCF4 control glioblastoma phenotype through an oxygen-dependent mechanism

Glioblastoma multiforme (GBM) is one of most common and still poorly treated primary brain tumors. This pathology represents a dramatic challenge for researchers and clinicians and the biology underlying this cancer is not yet fully elucidated. So far, the existence of a subpopulation of cancer stem cells, responsible for GBM growth and aggressiveness, has been extensively demonstrated. Thus, the possibility of reprogramming this subpopulation toward less aggressive phenotypes has been rapidly growing during years. To reach this aim, however, a more complete understanding of the mechanisms preserving Glioma Stem Cells (GSCs) phenotype is needed, in particular considering the role of the microenvironmental stimuli driving GBM cell proliferation and self-renewal. In this context, hypoxia has assumed a fundamental role as a key regulator of signaling pathways involved in GSCs proliferation and tumor progression. For this reason, the characterization of the hypoxic niche where GSCs reside revealed that hypoxia, through HIF-1α transcription factor, can regulate several biological processes which are exploited by different populations of cells in the tumor mass in order to survive. The Wnt/β-catenin/TCF cascade is one of the most important hypoxia-modulated pathway implicated in tissue development and in the progression of several human cancers. Interestingly, our laboratory previously characterized a biological process that impacts on GSCs phenotype and that is regulated in synchrony by HIF-1α and the Wnt pathway. Indeed, in hypoxic conditions, Wnt pathway activation is able to induce a pro-differentiating switch of GSCs toward neurons, weakening their aggressive phenotype. This process is strictly dependent from environmental oxygenation and can be exploited to reprogram GSCs and neutralize their resistance to treatments. Here, we deepen into the mechanisms underlying this pro-differentiating process in primary GBM-derived cells and, in particular, we aim to finely characterize the role of the Wnt pathway transcriptional effectors TCF1 and TCF4 in controlling GBM phenotype. Once observed that Wnt pathway activation was able to mediate two different phenotypic effects at different oxygen levels in GBM cells, we found that, in hypoxia, the observed neuronal differentiation process of GBM cells was mediated by a molecular complex formed by TCF1, HIF-1α and β-catenin. Moreover, ChIP-sequencing experiments confirmed the capacity of the above mentioned complex to sit on promotorial sequences above the DNA and, in turn, trigger the expression of specific genes involved in the neuronal differentiation processes. As a confirmation, TCF1 knockdown in GBM cells cultured in hypoxia completely blocked the neuronal differentiation process. On the other hand, TCF4 expression resulted to be preponderant in normoxia, where we assumed that TCF4E inhibitory isoforms could block this Wnt-dependent neuronal differentiation observed. Indeed, GBM cells cultured in normoxic conditions are characterized by an high expression of TCF4E which probably blocks the neuronal differentiation process mediated by TCF1 and HIF-1α. Moreover, in normoxic conditions ChIP-sequencing experiments suggested TCF4 as able to bind the same genomic regions controlled by the TCF1/HIF-1α molecular complex which assembles in hypoxic conditions. Further demonstrations for this hypothetical inhibitory function of TCF4 came from functional experiments in which we silenced TCF4 in normoxia. Herein, we observed an induction of the neuronal differentiation and a complete block of this process when GBM cells were forced to over-express the inhibitory isoforms TCF4E. In this study we demonstrated that the cooperation between the Wnt pathway transcriptional co-factor TCF1 and HIF-1α is able to induce a long-lasting neuronal differentiation process in GBM cells. Indeed, Wnt pathway activation induces a switch from a stem-like phenotype towards neurons and triggers, exclusively under hypoxia, a TCF1/HIF-1α-dependent transcription of neuronal differentiation genes. This process is impaired upon standard oxygen conditions (20% O2) by the binding of TCF4 to the same genes on distal sequences, thus exerting an inhibitory function on this process. In conclusion, we unveil a tightly regulated mechanism by which the TCF1/HIF-1α transcriptional complex is able to induce a reminiscent neuronal differentiation of GSCs, which might represent a future potential strategy to therapeutically weaken their aggressiveness.

Il Glioblastoma multiforme (GBM) è il più comune dei tumori cerebrali nell’adulto e rappresenta tuttora una patologia dalla prognosi molto infausta e senza trattamenti efficaci. Purtroppo i meccanismi biologici che portano alla formazione di questo tumore e che ne sostengono l’aggressività sono scarsamente caratterizzati. Finora molte evidenze scientifiche dimostrano come una piccola popolazione di cellule staminali tumori sia la responsabile dell’insorgenza e della crescita del GBM. Di conseguenza, la possibilità di riprogrammare queste cellule verso un fenotipo meno aggressivo e differenziato è stata valutata da molti ricercatori negli ultimi anni. Per capire in maniera più approfondita i meccanismi responsabili del mantenimento del fenotipo staminale di queste cellule diventa di fondamentale importanza studiare approfonditamente il microambiente circostante la massa tumore del GBM e caratterizzare gli stimoli che guidano la proliferazione e l’autorinnovamento delle cellule di GBM. Il microambiente tumore è costituito da un gradiente di ossigeno per cui le cellule tumori sfruttano bassi livelli di ossigeno, condizione denominata ipossia, per mantenere le loro caratteristiche staminali. Lo studio della nicchia ipossica in cui risiedono le cellule tumori di GBM ha portato alla dimostrazione che il fattore di trascrizione HIF-1α è responsabile del controllo di numerosi processi biologici responsabili del mantenimento del fenotipo scarsamente differenziato di queste cellule. Tra le molteplici vie di segnale regolate da HIF-1α troviamo il pathway di Wnt/β-catenin. Studiando le relazioni che intercorrono tra queste due vie di segnale, il nostro gruppo di ricerca ha caratterizzato un meccanismo biologico di differenziamento neuronale delle cellule di GBM indotto in sincronia dalle vie di segnale controllate da HIF-1α e Wnt. Questo processo risulta essere fortemente dipendente dai livelli di ossigeno presenti nel microambiente. Infatti, cellule di GBM coltivate in condizioni di ipossia vanno incontro a differenziamento neuronale dopo attivazione del pathway di Wnt. Tale processo potrebbe rappresentare uno strumento efficace per riprogrammare le cellule di GBM verso un fenotipo meno aggressivo e per questo motivo abbiamo approfondito i meccanismi che inducono tale processo nelle cellule primarie di GBM derivate da paziente. Il nostro obiettivo è stato quello di caratterizzare in maniera univoca il ruolo dei fattori trascrizionali TCF1 e TCF4, appartenenti alla via di segnale di Wnt, nel determinare il fenotipo del GBM. Abbiamo confermato che l’attivazione del pathway di Wnt induce due diversi effetti fenotipici nelle cellule di GBM a diverse concentrazioni di ossigeno. Successivamente abbiamo dimostrato che, in condizioni di ipossia, il differenziamento neuronale osservato nelle cellule di GBM è mediato da un complesso trascrizionale formato da TCF1, HIF-1α e β-catenin. Inoltre, esperimenti di ChIP-sequencing hanno confermato la capacità di questo complesso trascrizionale di regolare in maniera attiva specifiche sequenze genomiche del DNA delle cellule di GBM ed attivare la trascrizione di geni implicati in processi di differenziamento neuronale. Abbiamo confermato questi risultati silenziando TCF1 nelle cellule di GBM coltivate in condizioni di ipossia ed abbiamo dimostrato che il differenziamento neuronale, altrimenti indotto in presenza di TCF1, viene completamente bloccato dopo attivazione del pathway di Wnt. Al contrario, abbiamo riscontrato una preponderante espressione di TCF4 ad alti livelli di ossigeno (ossigeno ambientale, 20%), in cui le cellule di GBM non subiscono il differenziamento neuronale osservato in ipossia e mantengono un fenotipo prettamente staminale. Per giustificare tale fenotipo dopo attivazione del pathway di Wnt, abbiamo ipotizzato che, tra le molteplici isoforme di TCF4, quelle a carattere inibitorio sulla trascrizione potessero bloccare il processo di differenziamento neuronale, altrimenti attivato dal pathway di Wnt in ipossia, e favorire il fenotipo non differenziato delle cellule di GBM. Per dimostrare quest’ipotesi abbiamo silenziato TCF4 in cellule di GBM coltivate in normossia ed abbiamo osservato che l’attivazione del pathway di Wnt induce in maniera significativa il differenziamento neuronale osservato in ipossia. Inoltre, se le cellule di GBM sono forzate ad esprimere l’isoforma inibitoria di TCF4, TCF4E, il fenotipo acquisito dalle cellule di GBM risulta essere non differenziato, confermando la capacità di inibire tale processo in cellule di GBM coltivate ad alti livelli di ossigeno. In questo studio abbiamo dimostrato che la cooperazione tra il pathway di Wnt e HIF-1α è in grado di indurre un cambiamento nel fenotipo di cellule di GBM in condizioni di ipossia. Il processo di differenziamento neuronale osservato in queste cellule dipende esclusivamente dal microambiente e, in particolare, risulta essere specifico per cellule non differenziate di GBM coltivate in ipossia. La dimostrazione che è possibile modulare il fenotipo di queste cellule in maniera specifica e dipendente dai livelli di ossigeno rappresenta una potenziale strategia futura per ridurre l’aggressività e la resistenza ai trattamenti di queste cellule.