Realizzazione di un protocollo di coltura in vitro di tessuto endometriale equino e studio dell'espressione di geni correlati alla produzione di citochine infiammatorie dopo co-coltura dei campioni con due diverse dosi di cellule staminali mesenchimali.

Rossi, Melissa

Despite the presence of an intense research in the field of the equine reproduction over recent decades, there has been no significant increase in the population's fertility. To date, few therapeutic protocols are available for the treatment of equine reproductive disorders because of the peculiarities of species but also for the ethical, clinical and economical reasons adressed to the in vivo tests. An easily obtainable sample for performing reliable in vitro tests is the endometrial biopsy; however, the lack of studies regarding the maintenance of the vitality for this sample is still an obstacle. For this purpose, the first aim of the present work has been the creation of a protocol for the culture of equine endometrial biopsies; moreover, we assessed the survival of two different kind of biopsy (incisional and excisional) by the estimation of mitochondrial activity, DNA quantity and the histology of the samples at 3 and 7 days of in vitro culture at 37°C and 5% CO2. Results show that incisional biopsies maintain an adequate level of vitality up to 3 days, representing a valid sample to be used for in vitro testing. In addition, the method allows the evaluation of innovative therapies such as mesenchymal stem cells (MSCs). MSCs have been shown to support tissue regeneration and to modulate inflammatory processes. For these reasons, MSCs could be used in equine endometritis and/or endometrosis, inflammatory-based pathologies that represent one of the major reproductive diseases for horse because of reducing the fertility of the animal and increasing costs for breeders. However, further insights are needed to improve the knowledge about their mechanism of action and their practical use. On the light of that, the second aim of this project has been the evaluation of the expression of genes related to the production of inflammatory cytokines after co-culture for 3 days of incisional endometrial biopsies with two different doses of adipose derived stem cells (ADSCs) (1x10^5 and 3 x 10^5 cells). The preliminary results allow us to hypothesize that the presence of ADSCs modifies the expression of genes involved in the production of cytokines with an immunomodulatory effect and possible activation of anti-bacterial and anti-fibrotic mechanisms that could be the starting point for the restoration of damaged endometrium. In addition, for some cytokines this immunomodulatory effect seems to be dose-dependent and deserves further studies.

Negli ultimi decenni, nonostante si sia registrata un'intensa attività di ricerca nell'ambito della riproduzione equina, non si è verificato un significativo aumento della fertilità della popolazione. A oggi, le terapie disponibili per il trattamento di patologie della sfera riproduttiva sono limitate a pochi protocolli sia per le peculiarità di specie ma soprattutto per le difficoltà etiche, cliniche ed economiche che si devono affrontare per la sperimentazione di nuovi trattamenti in vivo. Un campione facilmente reperibile per eseguire tests da utilizzare in ambito riproduttivo è la biopsia endometriale; tuttavia, la mancanza di studi riguardanti il mantenimento della vitalità di questo tipo di campione quando coltivato in vitro rappresenta ancora un ostacolo. A questo scopo, il presente lavoro si è posto come primo obiettivo l’ideazione di un protocollo di coltura di tessuto endometriale equino e la valutazione della sopravvivenza di due diversi tipi di biopsia endometriale (incisionale ed escissionale) mediante stima dell'attività mitocondriale, della quantità di DNA e dell'aspetto istologico del campione a 3 e 7 giorni di coltura in vitro a 37°C e 5% CO2. I risultati dimostrano che con il protocollo testato le biopsie incisionali mantengono un livello adeguato di vitalità fino ai 3 giorni rappresentando un campione valido da utilizzare per prove in vitro. Inoltre, la metodica consente la valutazione di innovativi fronti terapeutici come quello delle cellule staminali mesenchimali (MSCs). Tali cellule si sono dimostrate capaci di favorire la rigenerazione tissutale e modulare i processi infiammatori. In quest’ottica le MSCs potrebbero trovare impiego nella terapia di cavalle affette da endometrite e/o endometriosi, patologie su base infiammatoria che rappresentano uno dei principali problemi in ambito riproduttivo andando a ridurre la fertilità dell'animale e ad aumentare i costi per gli allevatori. Tuttavia, le conoscenze riguardanti il loro meccanismo d'azione e il loro impiego pratico richiede ulteriori approfondimenti. A tal scopo, la seconda parte di questo progetto ha valutato l'espressione di geni correlati alla produzione di citochine infiammatorie dopo co-coltura per 3 giorni di biopsie incisionali endometriali con due diverse dosi di cellule staminali equine di origine adiposa (ADSCs) (1x10^5 e 3 x 10^5 cellule). I risultati, seppur preliminari, permettono di ipotizzare che la presenza delle ADSCs modifichi l'espressione di geni coinvolti nella produzione di citochine con effetto finale immunomodulante e con possibile attivazione di meccanismi anti-batterici e anti-fibrotici che potrebbero essere alla base del ripristino della funzionalità endometriale. Inoltre, per alcune citochine questo effetto immunomodulatorio sembra essere dose-dipendente e merita ulteriori approfondimenti.

Realizzazione di un protocollo di coltura in vitro di tessuto endometriale equino e studio dell'espressione di geni correlati alla produzione di citochine infiammatorie dopo co-coltura dei campioni con due diverse dosi di cellule staminali mesenchimali / Rossi, Melissa. - (2017 Oct 23).