IL 17beta-ESTRADIOLO REGOLA L'ESPRESSIONE DEL TRASCRITTO DI fRLX IN Rana esculenta. ISOLAMENTO DA CERVELLO DI RANA DI UN NUOVO MEMBRO DELLA FAMIGLIA DELLE RELAXINE/INSULINE E DI UN RECETTORE fRXFP3

Relaxin and Insulin-like factor (RLX and INSL) are small peptide hormones belonging to the Insulin/IGF/Relaxin superfamily, well characterized in Mammalian and only recently discovered in lower Vertebrates. Human Relaxin family peptides are encoded by seven different genes: RLX1, RLX2, RLX3, INSL3, INSL4, INSL5, and INSL6. Phylogenetic analysis suggests that they could derive from a duplication phenomenon that involved three genetic loci named Relaxin Family Locus (RFL) studied in lower Vertebrates (Park et al., 2008). Although the Relaxins are present in different anatomical districts, they are primarily associated to reproductive roles. Studies on non mammalian vertebrates are mostly recent and generic. Since Relaxin family loci are phylogenetically conserved among lower vertebrates, the existence of further members of RFL has been verified in Rana esculenta through a bioinformatics approach based on the genomic sequence of the amphibious Xenopus tropicalis. This analysis allowed us to identify four preserved putative genes in Xenopus tropicalis, corresponding to the three RFL families (RFLA, RFLB, RFLCI and CII). We designed several degenerate primers, based on the nucleotidic alignment of the identified sequences, then used in RT-PCR experiments on total RNA extracted from some frog tissues. A couple of primers which targeted RLX3 (RFLCI) sequence we managed to amplify a 360 bp cDNA fragment, exclusively expressed in frog encephalon. Its identity was verified by cloning and sequencing. The putative translation of the nucleotidic sequence showed a 120 A.A. open reading frame. Sequence analysis by blastx showed that fRLX3 is homologous to mammalian RLX3 proteins. In particular, 8 there is notable structural similarity in the highly conserved B and A domains, typical of all the members of Relaxin family. It is worth noting that the Relaxin-3 is expressed in the nervous system at the level of nucleus incertus neurons in Variolo bridge, structure present in the encephalic trunk, and it seems to play the role of neuro-peptides or neuro-modulator. In order to understand if the expression profile of frog Relaxin-3 had the same trend than the one found in the mammalian CNS, an RT-PCR experiment was performed on total RNA extracted from different frog encephalic areas: in toto brain, telencephalon, diencephalon and mesencephalon. The first analysis showed that the transcript is highly and specifically expressed in the mesencephalic and diencephalic vesicles, while at telencephalic level the signal resulted lower, as already reported in mammals. In order to gather crucial knowledge about functional implication of fRLX and fRLX3, we had to identify and characterize any potential RLX receptors in the frog. Four relaxin receptors are known so far: RXFP1 (specific Relaxin receptor in mammals), RXFP2 (INSL3 receptor), RXFP3 (RLX3 receptor) and RXFP4 (INSL5 receptor). Using the same approach described earlier we designed degenerate primers for an RT-PCR, in order to isolate the receptors. We were able to amplify, from brain cDNA, a specific 327 nucleotidites band, homologous to mammalian RXFP3. As RXFP3 is the specific receptor to Relaxin-3,we carried out an expression analysis of fRXFP3 in the different encephalic areas of frog. The RT-PCR allowed us to determine that the expression of frxfp3 mRNA is not completely consistent with that of its ligand’s. In fact, while fRLX3 transcript is primarily detectable in the Mesencephal, we could not determine any significant difference in rxfp3 mRNA expression in the three encephalic regions. These data coincides with those about mammals. In fact, as stated previously, anatomical 9 evidences suggest that the RLX3 is produced by GABA neurons soma present in the Variolo bridge and in the mesencephal; it is subsequently transferred through assonal transport and released in the sinaptics or extrasinaptics sites in the forebrain, where it activates its cognate receptor, RXFP3, produced by the postsinaptic neurons.

La Relaxina e l’Insulin-like factor (RLX e INSL) sono piccoli ormoni peptidici appartenenti alla superfamiglia dell’Insulina/IGF/Relaxine, ben caratterizzati nei Mammiferi e solo di recente ritrovati in modelli compresi in gruppi tassonomici di bassi Vertebrati. I peptidi appartenenti alla famiglia delle Relaxine sono codificati nell’uomo da sette geni differenti: i geni Relaxina RLX1, RLX2 e RLX3, i geni insulina simile INSL3, INSL4, INSL5, e INSL6 (Halls et al., 2007; Wilkinson et al., 2005b, Olinski, 2007). Analisi filogenetiche suggeriscono che essi possano derivare da un fenomeno di duplicazione che coinvolge tre locus genici denominati Relaxin Family Locus (RFL) evidenziati nei bassi vertebrati (Park et al., 2008). Benché le Relaxine siano presenti in diversi distretti anatomici, ricerche effettuate su Mammiferi ne associano le principali funzioni ai fenomeni riproduttivi. Per quanto concerne i Vertebrati nonmammiferi la ricerca sulle possibili funzioni è ad oggi un campo ancora completamente aperto. Vista la conservazione di locus genici della famiglia delle Relaxine nei bassi vertebrati, è stata verificata l’esistenza di ulteriori forme di RFL in Rana esculenta tramite un approccio bioinformatico analizzando il genoma dell’anfibio Xenopus tropicalis. Quest’analisi ha permesso di identificare quattro geni putativi conservati in Xenopus tropicalis corrispondenti alle tre famiglie RFL (RFLA, RFLB, RFLCI e CII). Sulla base dell’allineamento nucleotidico dei trascritti identificati, è stato dunque possibile disegnare coppie di oligonucleotidi “degenerati” da utilizzare in esperimenti di RT-PCR su RNA totale estratto da diversi tessuti di rana. In questo modo, utilizzando una coppia di primers disegnati sulla sequenza della RLX3 (RFLCI) si è ottenuto un amplificato di circa 360 cb, espresso esclusivamente nell’encefalo di rana. La banda ottenuta è stata, quindi, clonata e sequenziata: la sequenza ottenuta, una volta tradotta, presenta una cornice di lettura aperta di 120 aminoacidi. Tale sequenza, in seguito ad analisi in blastx, ha mostrato un’alta omologia con le proteine della famiglia delle Relaxine 3 depositate in banca dati genomica. In particolare, risultano essere altamente conservati il dominio strutturale della catena B e quello della catena A tipici di tutte le proteine appartenenti a questa famiglia. E’, inoltre, da tener presente che, nei mammiferi, la Relaxina-3 è espressa nel sistema nervoso a livello dei neuroni del nucleo incerto del ponte di Variolo, struttura presente nel tronco encefalico dove sembra svolgere la funzione di neuropeptide o neuromodulatore (Tregear et al., 2005; Sherie Ma. et al., 2009). Per verificare se il profilo di espressione della Relaxina-3 di rana fosse sovrapponibile a quello riscontrato nel SNC di mammifero, è stato effettuato un esperimento di RT-PCR su RNA totali estratti da differenti aree encefaliche di rana: cervello in toto, telencefalo, diencefalo e mesencefalo. Una prima analisi ha mostrato che il trascritto è altamente e specificamente espresso a livello della vescicola mesencefalica e diencefalica, mentre a livello del telencefalo il segnale risulta essere più basso, così come già evidenziato nei mammiferi. Parallelamente, al fine di poter intraprendere un discorso di tipo funzionale sul ruolo svolto da fRLX e fRLX3, si è cercato di identificare e caratterizzare i possibili recettori presenti in rana. Dalla letteratura risultano quattro recettori per le relaxine: RXFP1 (recettore specifico della Relaxina di mammifero), RXFP2 (recettore di INSL3), RXFP3 (RLN3) e RXFP4 (INSL5) (Bathgate et al., 2006) . Attraverso un’analisi di tipo bioinformatica basato sull’allineamento delle putative sequenze dei recettori presenti in banca dati, sono state disegnate delle coppie di primers degenerati che hanno permesso di amplificare dal cDNA di cervello di rana una banda specifica della lunghezza di 327 nucleotidi con sequenza molto conservata rispetto al recettore RXFP3 dei mammiferi. Dal momento che RXFP3 è il recettore specifico della Relaxina 3, si è deciso di effettuare anche un’analisi del profilo di espressione di fRXFP3 nelle diverse aree encefaliche di rana. L’analisi di RT-PCR ha mostrato che l’espressione di tale trascritto non corrisponde perfettamente a quella descritta per il ligando. Infatti, mentre i trascritti per fRLX3 sono maggiormente espressi a livello del Mesencefalo, non si osserva alcuna significativa differenza di espressione per l’mRNA di fRXFP3 a livello del Telencefalo e del Diencefalo. Questo dato coincide con quelli analizzati nei mammiferi. Infatti, come precedentemente affermato, evidenze anatomiche suggeriscono che la RLN3 sia prodotta nel soma dei neuroni GABA presenti nel ponte di Variolo e nel mesencefalo; essa è successivamente trasferita tramite trasporto assonale e rilasciata a livello dei siti sinaptici o extrasinaptici nella parte anteriore del cervello, dove attiva il suo recettore RXFP3 espresso dai neuroni postsinaptici (Tregear et al., 2005; Sherie Ma. et al., 2009).