Structural and functional characterization of second pilus type in Streptococcus pneumoniae

Streptococcus pneumoniae is one of the most important human pathogens and a major cause of morbidity and mortality worldwide, causing respiratory tract infections, community acquired pneumonia, and invasive diseases. Although the pneumococcus is a well studied bacterial pathogen, first described in the late 19th century, pili on its surface were discovered only recently. Pili are elongated structures protruding from the bacterial surface and found to be important virulence factors in both Gram-positive and Gram-negative bacteria. In contrast to Gramnegative pili, little was known about the structure of Gram-positive pili. In the recent years the structure and function of the first pilus type (pilus-1) has been elucidated and a second pilus type (pilus-2) in S.pneumoniae has been characterized. Here we describe the genomic organization of a second PI, PI-2, identified in the partial genome sequence of a serotype 1 S. pneumoniae strain (INV104). Furthermore we provide experimental evidence that PitB is the backbone protein forming the pilus-2 shaft. We also confirm that both the sortase SrtG1 and the signal peptidase-related protein SipA, are necessary for assembly and polymerization of the pilus. In order to study the pneumococcal pilus in detail, a purification procedure was set up to obtain pure native pili preparations. Pneumococcal pili were isolated from strain PN110, bacteria that in low-dose EM showed individual pili and bundles of individual pili on the bacterial cell surface.

Streptococcus pneumoniae è uno dei più importanti patogeni che causa malattie e mortalità in tutto il mondo, quali infezioni del tratto respiratorio, otite media, setticemia, polmoniti e meningiti. Sebbene pneumococco fosse un batterio studiato con attenzione già dal 19esimo secolo, solo recentemente si sono scoperte delle strutture dette pili che protrudono dalla superficie del patogeni. Come si riscontra in letteratura, i pili sono importanti fattori di virulenza sia nei batteri Gram-positivi che nei Gram-negativi, quest'ultimi più studiati. Al contrario, si sa ancora poco delle strutture e delle possibili funzioni dei pili nei batteri Gram-positivi. Analizzando i genomi completi disponibili di S. pneumonie, abbiamo individuato una regione di 6,575 bp, che abbiamo chiamato pilus islet 2 (PI-2), contenente geni tipici di isole codificanti per pili nei Gram-positivi. In particolare, all'interno dell'isola abbiamo identificato 5 geni: due che codificano per due proteine ancorate alla superficie batterica tramite il motivo LPXTG (PitA, PitB), uno che codifica per una signal peptidasi (SipA) e due per due sortasi (rispettivamente SrtG1 e SrtG2). Tramite esperimenti di Western blot, FACS analisi ed immuno elettro microscopia (IEM) condotti su mutanti isogenici difettivi per l'espressione dei singoli componenti dell'isola, abbiamo dimostrato che PitB rappresenta lo scheletro del pilo, mentre la sortasi SrtG1 e la signal peptidasi SipA sono necessarie per l'assemblaggio e la polimerizzazione del pilo stesso. L'espressione di PitA, ipotetica proteina ancillare del pilo, risulta invece controversa. Infatti, il gene contiene uno stop codon nei nove ceppi sequenziati ad eccezione di uno in cui il gene è presente con il codone di stop seguito da un frameshift. Esperimenti di western blot eseguiti su preparati batterici trattati con mutanolisina e supernatanti concentrati di ceppi WT e relativi mutanti hanno evidenziato la presenza di una banda. Tale banda, assente nel knock-out di pitA, è compatibile con l'espressione della proteina intera nel WT indicando, come già riportato in letteratura, che lo stop codon potrebbe essere letto come triptofano. Ulteriori esperimenti sono stati eseguiti per accertare l'effettiva espressione di PitA, tramite l'utilizzo di diverse tecniche e nuovi anticorpi ottenuti contro diverse porzioni della proteina. Inoltre, allo scopo di effettuare una caratterizzazione strutturale del pilo2 mi sono occupata della purificazione del pilo2 in forma nativa a partire da supernatanti di coltura concentrati. Esperimenti di immuno elettro microscopia, effettuati usando anticorpi -PitB, su batteri cresciuti ON, hanno evidenziato che il pilo di tipo 2 (PI-2), a differenza del pilo di tipo 1 (PI-1), è presente in singola copia sulla superficie dei batteri e sembra essere più spesso e più corto.