SCREENING MOLECOLARE DELLA SINDROME PARAGANGLIOMA E STIMA DELLA PREVALENZA DELL'ALLELE MUTATO SDHD p.Y114C

Paragangliomas (PGLs) are rare tumors that derive from sympathetic chromaffin tissue in adrenal (Pheocromocytoma, Pheo) and extra-adrenal abdominal or thoracic locations, or from parasympatetic tissue of the head and neck (HNP). PGL syndrome is caused by germline mutations in the SDHB (1p36), SDHC (1q21), SDHD (11q23) and SDAF2 (11q13) genes, and it is characterized by variable expression and incomplete penetrance. This syndrome follows an autosomal dominant transmission but, when caused by mutations in the SDHD and SDAF2 genes it behaves as a parent-of-origin disease: inheritance of paraganglioma occurs only when paternally transmitted. I performed a molecular screening of the SDHB/C/D genes in 94 patients with manifestation or suspected of PGL syndrome and I have found 10 mutations (10,6%): 5 mutations in the SDHB gene (p.S152Y, p.E175X, p.Q235X, p.S239FfsX8, p.R242H), 1 mutation in the SDHC gene (p.R50C) and 4 mutations in the SDHD gene (IVS1+1G>A, IVS2+1G>C, IVS2-1G>T, p.P81L). The mutation frequency found in each gene was in agreement with that reported in LOVD (Leiden Open Variation Database). MLPA analysis, performed on samples resulted negative after molecular screening, did not revealed any rearrangements in the SDHB/C/D genes. Subsequently, I have estimated the prevalence of the founder mutation p.C114Y, just identified in some patients with HNP and coming from Trentino region. 4.025 subjects of the general population living in three Trentino valleys (Val dei Mocheni - Altopiano di Pinè - Val di Cembra) were analyzed. DNA was collected and extracted from buccal swab; all samples were analyzed with Allelic Discrimination and DHPLC and positive samples were then confirmed with direct sequencing. The mutation p.Y114C has been identified in 59 subjects: 46 with a negative family history and 13 with familiarity. The overall prevalence of the mutation was 1.5% with highest prevalence in Mocheni valley and progressively lower prevalence in the Pinè tableland and in Cembra valley. This may suggest the origin of the founder mutation in the Mocheni valley and the following spread to the other two valleys. The living population of this area is more than 70.000 people and we can estimate the presence of 1.000 carriers. This estimation is very 8 important for the clinical management in positive carriers because they can manifest HNP. The present study confirms the importance of genetic analysis of patients affected or at risk to develop PGL syndrome.

La Sindrome Paraganglioma è una sindrome tumorale ereditaria a carico dei paragangli simpatici e parasimpatici. Nello specifico i tumori associati al sistema simpatico possono originare nella midollare del surrene, ed in tal caso vengono chiamati feocromocitomi, oppure nei gangli simpatici dell’addome e del torace; diversamente i tumori associati al sistema parasimpatico originano nella testa e nel collo e vengono chiamati paragangliomi testa-collo (Head and Neck Paraganglioma, HNP). La Sindrome Paraganglioma si distingue in Sindrome PGL1 (Sindrome Paraganglioma di tipo 1), PGL2, PGL3, PGL4 a seconda che sia causata rispettivamente da mutazioni a carico dei geni SDHD, SDHAF2, SDHC e SDHB. La modalità di trasmissione delle Sindromi è autosomica dominante con penetranza incompleta ed espressività variabile, fanno eccezione le sindromi PGL1 e PGL2 in cui si ha manifestazione del fenotipo tumorale solo se la mutazione viene ereditata per via paterna. Nel presente lavoro 94 pazienti affetti o con sospetta Sindrome Paraganglioma sono stati analizzati per la ricerca di mutazioni germinali puntiformi, microdelezioni/inserzioni nei geni di suscettibilità, mediante la tecnica del sequenziamento diretto. Lo screening molecolare ha portato all’identificazione di 10 mutazioni germinali così distribuite: 5 nel gene SDHB (p.S152Y, p.E175X, p.Q235X, p.S239FfsX8, p.R242H) 1 nel gene SDHC (p.R50C) e 4 nel gene SDHD (IVS1+1G>A, IVS2+1G>C, IVS2-1G>T, p.P81L). La percentuale di mutazioni trovata in ciascun gene è in accordo con quanto riportato nel LOVD (Leiden Open Variation Database). Per le varianti a significato ignoto è stata effettuata un’analisi in silico sia funzionale che strutturale. Trattandosi tuttavia di predizioni basate su algoritmi probabilistici, l’eventuale ruolo patogenetico di tali varianti è stato valutato analizzandole in un campione sano proveniente dalla stessa popolazione generale. I pazienti privi di mutazioni puntiformi, micro-elezioni/inserzioni sono stati analizzati per l’eventaule presenza di eventi molecolari più estesi (delezioni/duplicazioni) mediante la tecnica Multiplex Ligation Probe Assay (MLPA). L’analisi effettuata tuttavia non ha mostrato evidenze di possibili delezioni o duplicazioni di interi esoni o dell’intero gene SDHB, SDHC o SDHD. Lo screening molecolare a carico dei geni di suscettibilità della Sindrome Paraganglioma ha permesso di identificare nuove mutazioni nonché la presenza di portatori asintomatici, ai quali è stata fornita una diagnosi precoce ed un follow-up continuo. Nel presente lavoro è stata inoltre stimata la prevalenza della mutazione SDHD p.C114Y, in un campione generale della popolazione (4.025 individui) presente nelle valli trentine (Val dei Mocheni - Val di Cembra - Altopiano di Pinè), nelle quali era stata precedentemente individuata un’alta incidenza di HNP causata dalla presenza di un “effetto fondatore”. Gli individui sono stati analizzati per la presenza/assenza della mutazione fondatrice SDHD p.Y114C, mediante discriminazione allelica e DHPLC. I portatori della mutazione sono stati poi riconfermati mediante sequenziamento diretto. L’analisi effettuata ha permesso di identificare 59 portatori della mutazione: 13 (22%) con storia familiare positiva e 46 (78%) con storia familiare negativa. La stima della prevalenza della mutazione p.C114Y è risultata pari a 1.5%, con una prevalenza maggiore in Val dei Mocheni e progressivamente più bassa nell’Altopiano di Pinè e nella Val di Cembra. Poiché la densità demografica delle valli analizzate è pari a 70.000 abitanti, si può stimare la presenza di circa 1000 carriers della mutazione. Lo studio effettuato dimostra l’importanza dell’analisi genetica in pazienti affetti o a rischio di sviluppare la Sindrome Paraganglioma.