Nervous system differentiation in the colonial ascidian Botryllus schlosseri: molecular and cellular aspects and evolutive implications

In the last years, several studies are addressed to the investigation of mechanisms that permitted the appearance and evolution of those structures considered as extremely important in the vertebrates radiation. The rise of vertebrates was accompanied by the acquisition of a great complexity in the structural plan of the organisms that is related to the evolution of features associated with the nervous system, such as neural crests, cranial placodes and an elaborated brain. The aim of the doctoral project is inserted in this line of research. Particularly, the attention is addressed to those characters, which in the non- vertebrate chordates can be interpreted as crucial for the subsequent evolution of the vertebrate body-plan. The starting point is represented by previous morphological studies that evidenced the presence, in the tunicate embryo, of transitory ectodermal and multipotential territories located at the neural plate border. Our research, carried out using different approaches, is focused on the characterisation and description of structures that differentiate from these domains. In this regard, it is investigated the organisation of the larval papillae and their formation from the rostral placode. These structures play a pivotal role in triggering the mechanisms and changes that characterise the metamorphosis, which in ascidians constitute the lost of the chordate body-plan of the larva and the begin of the sessile post-embryonic phase. The analysis of the sensory components in ascidians, finalised to the identification of homologies with the structures that derive form the placodes in vertebrates, is also extended to the coronal organ. The coronal organ is recently discovered and possesses morphological, positional and ultrastructural features that, together with the presence of hair cells, are comparable to the lateral line and inner ear of vertebrates, which components derive from the acoustic-lateral placodes. A substantial part of the work is dedicated to the investigation, with a molecular approach, of the presence of structures comparable to the neural placodes in ascidians. The attention is focused on the colonial ascidian Botryllus schlosseri that permits a comparative study on the mechanisms and genic networks involved in both embryogenetic and blastogenetic development. We characterised orthologues of placodal genes and constructed probes for in situ hybridisation experiments. During the stages of bud differentiation, we localised territories interested by expression of genes normally involved in the placodal induction and specification in vertebrates. These regions, for their position and differentiative potentialities, are comparable to other embryonic domains of B. schlosseri that are considered as homologues to the neural placodes. The larva of ascidians possesses a striated symmetrical musculature sharing some features with that of vertebrates and it flanks the dorsal tube and the notochord, representing a peculiar propriety of chordates. The acquisition of this new locomotory system probably required the parallel appearance of a sophisticated control of the coordination. The nervous system established new interactions and differentiated sensory structures that permitted the rapid perception of the environment by the mobile organism. At metamorphosis, the larval musculature is reabsorbed, while the cardiac and unstriated muscle fibres differentiate de novo from circulating mesenchymal cells. This plasticity constitutes the source of the evolutive potentiality of ascidians and thus we investigate its molecular and morphological bases. We isolated and characterised transcripts coding for muscle-specific genes, analysing the expression during the blastogenetic cycle of Botryllus, from the bud appearance to the adult regression. The use of different methods allowed the description of the organisation and differentiation of the unstriated muscle, confirming its unique proprieties. Taking together, our results contribute to the understanding of the origin and development of structures that represent an important starting point in the evolution and radiation of vertebrates.

Negli ultimi anni numerosi studi si sono rivolti all’approfondimento di quei meccanismi che hanno permesso la comparsa ed evoluzione di strutture ritenute di estrema importanza nella radiazione dei vertebrati. La comparsa dei vertebrati è stata accompagnata da un enorme balzo nella complessità del piano strutturale degli organismi, largamente ascrivibile all’evoluzione di strutture associate al sistema nervoso come le creste neurali, i placodi craniali ed un cervello elaborato. La tematica trattata durante lo svolgimento del progetto di dottorato si inserisce in questa attuale linea di ricerca. In particolare, l’attenzione è stata rivolta a quei caratteri che nei cordati non-vertebrati possono essere letti come cruciali per la successiva evoluzione del piano strutturale dei vertebrati. Il punto di partenza è rappresentato da precedenti studi morfologici che hanno evidenziato la presenza, nell’embrione dei tunicati, di territori ectodermici transitori e multipotenti localizzati al confine con la piastra neurale. Il nostro studio, svolto mediante l'utilizzo di vari approcci metodologici, si è rivolto alla caratterizzazione e descrizione delle strutture che queste aree sono in grado di differenziare. A questo proposito, è stata analizzata l’organizzazione delle papille larvali e la loro formazione a partire dal placode rostrale. Queste strutture giocano un ruolo primario nell’innescare i meccanismi e i cambiamenti che caratterizzano la metamorfosi, ovvero quel processo che nelle ascidie segna la perdita del piano corporeo da cordato della larva e il passaggio alla fase post-embrionale sessile. L’analisi riguardante strutture sensoriali presenti nelle ascidie, allo scopo di identificare eventuali omologie con le corrispondenti strutture derivanti dai placodi nei vertebrati, è stata poi estesa all’organo coronale. L’organo coronale è stato scoperto solo recentemente e presenta caratteristiche morfologiche generali, posizionali e ultrastrutturali tali, come la presenza di cellule capellute, che lo rendono comparabile alla linea laterale ed all’orecchio interno dei vertebrati, i cui componenti derivano dai placodi acustico-laterali. Una parte consistente del lavoro è stata dedicata all’indagine, da un punto di vista molecolare, della presenza di strutture accomunabile ai placodi neurali nelle ascidie. L’attenzione è stata rivolta all’ascidia coloniale Botryllus schlosseri, che permette di svolgere uno studio comparativo sui meccanismi e reti geniche che intervengono sia durante lo sviluppo embriogenetico che blastogenetico. Abbiamo caratterizzato specifici geni e prodotto sonde utilizzate in esperimenti di ibridazione in situ. Durante le fasi di differenziamento della gemma sono stati individuati specifici territori caratterizzati da espressione di alcuni geni normalmente coinvolti nell’induzione e specificazione placodale nei vertebrati. Grazie alla loro posizione e potenzialità differenziativa, queste stesse regioni sono apparse confrontabili con altri territori embrionali di B. schlosseri e di altre ascidie considerati omologhi a placodi neurali dei vertebrati. La larva delle ascidie presenta una muscolatura simmetrica striata, con caratteri comuni a quella dei vertebrati, la quale fiancheggia il tubo dorsale e la notocorda e che rappresenta una proprietà peculiare dei cordati. L’acquisizione di questo nuovo sistema locomotorio ha verosimilmente richiesto la comparsa parallela di un sofisticato sistema di controllo della coordinazione. Il sistema nervoso ha stabilito nuove interazioni e differenziato strutture sensoriali che hanno permesso all’organismo mobile la rapida percezione dell’ambiente circostante. Alla metamorfosi, la muscolatura larvale viene completamente riassorbita, mentre le fibre muscolari non striate della parete del corpo e quelle cardiache si differenziano de novo da cellule mesenchimali circolanti. Questa plasticità sta alla base della potenzialità evolutiva delle ascidie e quindi ne abbiamo indagato le basi molecolari e morfologiche. Abbiamo quindi isolato e caratterizzato trascritti e geni muscolo-specifici, studiandone l’espressione durante il ciclo blastogenetico di Botryllus, dalla comparsa della gemma alla regressione dell’adulto. L ’utilizzo di vari approcci ha permesso la descrizione dell’organizzazione e differenziamento della muscolatura non striata, confermandone le caratteristiche uniche. Nel complesso i diversi risultati rappresentano contributi significativi per la conoscenza delle origini e sviluppo quelle strutture che hanno rappresentato un punto di partenza importante nell’evoluzione e radiazione dei vertebrati.