LA CURA DEL PAZIENTE CON EPATITE C: dall'epidemiologia alla buona pratica clinica attraverso metodologie sperimentali e di laboratorio.

The increasing morbidity and mortality for liver diseases and particularly for hepatocellular carcinoma (HCC) widely started worldwide screening programs and healthcare strategies targeting on the early diagnosis and care of chronic viral hepatitis. This PhD thesis focused on care of patients with chronic hepatitis C by the study of the epidemiologic, clinical and experimental profile: a) to identify patients with the higher risk of liver damage and clinical evolution and b) to applied the most effective antiviral therapy schedule consisting of Peg-IFN and ribavirin, the only applicable chance for allowing viral eradication and avoiding progressive liver damage and related-complications. Therefore the research consists in 4 studies that described: 1. the characterization of viral HCV infection in the Veneto region, 2. the identification of non-invasive serum and tissue markers of liver fibrosis useful for the staging of liver viral disease, 3. the adherence to antiviral therapy and pathogenic mechanisms of depression induced by interferon; 4. the use of the antiviral therapy in the Veneto region: analysis of costs and effectiveness. Project descriptions: 1. Background: Chronic HCV infection represents a major cause of end-stage liver disease and liver cancer worldwide. Antiviral therapy is the only effective chance to allows viral eradication and to avoid progression of liver damage. Aim of the study: This analysis dealt with about 3,000 cases with chronic hepatitis C who underwent a clinical follow-up, according to the stage of liver disease (chronic hepatitis or cirrhosis, respectively every 6 or 12 months) and that were recruited for antiviral treatment with Peg-IFN-alfa and ribavirin, when indicated, with the purpose of viral eradication and of related cost-analysis to derive the golden healthcare strategy. Methods: Virological tests were performed a) to determine the HCV-genotype, based on reverse hybridization, where in addition to the region 5'NC, was also considered the core region to useful subtyping of HCV-genotype 1 (method: VERSANT HCV 2.0, INNO-LIPA) and b) to monitor viral load or serum HCV-RNA by a quantitative assay (method: COBAS TaqMan Real-Time PCR, linearity range 43-69000000 IU/mL) before, during and after (6 months) of therapy. A statistical analysis was performed to compare the distribution of genotypes in 2 subset of cases with onset of infection before or after 1995 (the date of application routine screening for HCV by techniques of molecular biology) and to identified the best response predictor to antiviral therapy. Results: During a FU-period of 5 years, respectively 1949 and 978 cases with suggestive HCV infection exposure before or after 1995 were analyzed. The comparison showed a significantly difference in epidemiologic characteristics of the population and of the HCV-genotype profile distribution, confirming the concurrent presence of at least 2 HCV-outbreaks characterized: the first, by previous transfusion risk, older age and HCV infection with viral genotypes 1b and 2 and presence of cirrhosis in 24% of cases, the second, mainly by males, younger, with a history of drug abuse, HCV genotype 1a, 3 and 4 and presence of cirrhosis in 10%. Overtime the number of infection with HCV-1b and 2 decreased of 10% (72.8% vs. 62.8%), while the HCV-1a, 3 and 4 increased (27.2% vs. 37.2%) (p <0.01). ROC curves were used to assess the main predictive viral load related to a sustained virologic response to therapy (or absence of viral replication 6 months after cessation of treatment) identifying a cut-off of HCV-RNA <5.2 log (IU/mL) with an Odds Ratio equal to 6 fold respect to higher levels of viraemia (p<0.001). Conclusions: Two cohort of patients with chronic HCV infection were identified by the epidemiological profile, characterized by a different genotype distribution. The best virologic predictor of response to therapy was the lower viraemia at baseline. 2. Background: Recently the ov-serpin squamous cell carcinoma antigen (SCCA) was detected in serum associated with IgM (SCCA-IC) in about one third of patients with chronic hepatitis and in up two third of cases with hepatocellular carcinoma. The development of standardized ELISA and ICH methods for determination of SCCA in serum and liver makes these biomarkers very interesting for their potential clinical relevance. Aim of the study was to relate serum levels and tissue SCCA to histological evolution during chronic HCV infection. Material and Methods: Sixty-three consecutive out-patients (33/30 M/F; mean age 48,2±12,2 yrs) with chronic hepatitis, HCV-RNA positive, that underwent biochemical tests and liver biopsy, were tested for SCCA-IC (Hepa-IC, Xeptagen, Italy) and tissue-SCCA (Hepa-Ab, Xeptagen) at the same time. Ishak histologic score was used for necro-inflammatory grading and fibrosis staging. Steatosis degree was scored as: 1 (0-10%) or 2 (>10%) of hepatocytes (x40). The normal upper limit of SCCA-IC was 120 AU/ml, while tissue-SCCA was undetectable in controls. Statistical evaluation was performed by T-test, U-test and Chi-square test as appropriate. The accuracy of SCCA-IC to diagnose disease evolution was defined by ROC curve analysis. Results: Based on histological findings the study population was grouped in cases without (<F3) and with (>F3) septal fibrosis. Serum SCCA-IC levels and liver-tissue SCCA showed a significant correlation (p=0.01). ROC curve analysis for comparison of SCCA-IC levels in cases without and with liver disease evolution discriminated the value of 190 AU/ml as the best cut-off for the prediction of evolution. Conclusions: Serum SCCA-IC appears significantly correlated to SCCA expression in the liver and being circulating levels significantly higher in patients with liver disease evolution. This serum marker may represent a simply and reliable predictor of early progression to HCV-related cirrhosis. 3. Background: Peg-interferon (IFN) and Ribavirin (RBV) is the antiviral standard of care for chronic hepatitis C (CHC). This drug-schedule can provoke in about 15-60% of cases, moderate-severe mood affections threatening adherence to therapy. Since IFN doesn’t cross blood-brain barrier, the role of a second messenger mediating the neuro-psychiatric disorders is discussed and particularly cytokines IFN-induced, through lymphocytes T activation, could have an influence on the mood by modulation of serotonine and kynurenine systems. Aim of the study was to evaluate the prevalence and severity of depressive symptoms during Peg-IFN and RBV antiviral therapy for CHC and than a) to identify risk-cases for neuro-psychiatric symptoms and to compare the different scales used for predicting early anxiety-depressive axis alterations, particularly between the self & hetero administrations, b) to correlate neuro-psychiatric side effects to serum tryptophan and kynurenine levels, and c) to prevent anxiety and depression, ameliorating adherence and compliance to antiviral therapy using SSRI. Methods: Thus, fifty-three out-patients with CHC prospectively recruited in our hepatologic unit, received an antiviral schedule with Peg-IFN-alpha 2a or 2b plus Ribavirin according to genotype (HCV-1-4 for 48 weeks and HCV-2-3 for 24 weeks). The study was done by a trained medical staff and using standard methods as: the Mini International Neuropsychiatric Interview, Hamilton Depression and Anxiety scale, Beck Depression Inventory and Hospital Anxiety and Depression Scale and respective cut-off to grade neuropsychiatric affections. Measurement of tryptophan and kynurenine were analysed by HPLC and the mean changes in biological measures and the intensity of depressive symptoms were estimated by ANOVA overtime: at baseline, 4 and 24 wks during therapy and 3 months after the end-of-therapy. Results: At baseline, 6 cases had a diagnosis of Major Depressive Disease (MDD) as defined by MSD-IV international criteria and fourteen cases developed an IFN-induced depressive disease (IFN-DD) after 4-24 wks of therapy. All these cases were supported with SSRI administration. None of risk-patient dropped-out from this study. All cases showed an evident level-drop in the tryptophan levels, while kynurenine showed a spike after 4-24 weeks of therapy, confirming the patho-physiological involvement of this pathway on TRP depletion by the increase of the KYN/TRP ratio. Conclusions: The prevalence of Peg-IFN-induced depression disease (IFN-DD) reached 30% of cases in the present study, showing in all cases a mild grade of mood affection by all psychiatric scales used. After 4-wk of therapy, a BDI score >9 points identified cases with high-risk of IFN-DD. Subjects with IFN-DD showed a significant correlation with the decrease in serum tryptophan more than 2 ug/mL respect to baseline levels and this feature was closely associated to increase of kynurenine levels and KYN/TRP ratio in all cases. Treatment with SSRI in risk-cases, strongly restored QoL and adherence to antiviral therapy and reverted serum tryptophan depletion. 4. Background: The use of Peg-interferon (IFN) alpha-2a or 2b type plus Ribavirin (RBV) for chronic hepatitis C therapy in real life practice is significantly targeted to avoid the three fold mortality rates associated to untreated cases, by inducing viral eradication and liver damage regression, so as to define the patients “definitively cured” from liver disease. Aim of this analysis was to describe the modalities of antiviral treatment in the Veneto region, in particular the therapy-schedule mainly used and compare the cost-efficacy of treatment with the 2 available Peg-IFNs with strategies proposed as in the every day practice. Methods: Twelve on-line hepatologic units, centralized by a network prospectively collected data of 450 subjects that underwent antiviral therapy for chronic hepatitis or cirrhosis. A post-hoc retrospective analysis of cases treated from January 2003 to December 2005 was performed, grouping the study population in 167 cases treated with Peg-IFN alpha-2a (PEGASYS, Roche, fixed-dose of 180μg/weekly) and 288 that received Peg-IFN alpha-2b (PEG-INTRON, Schering-Plough, weight-adjusted-dose from 50 to 150 μg/weekly), both in combination therapy with Ribavirin (RBV). Results: Overall SVR, obtained with the Peg-IFN-α2a or α2b plus RBV regimens, was the same (61%), however Peg-IFN-α2b was used at a suboptimal dose in 58% of cases that received <1mcg/kg/week, while 95% of cases treated with Peg-IFN-α2a received the 180 mcg/week. Thus, cases treated with Peg-IFN-α2b<1, showed a lower SVR than those treated with a dose>1mcg/kg/week, respectively 50%vs.66% (p=0,006), particularly in HCV-genotype 1 and 4 (32% vs. 53%; p=0,00). Conclusions: By one-way sensitivity analysis, the Peg-IFN-α2b>1 or Peg-IFN-α2a schedules were favoured in HCV-genotype 1 and 4, while the Peg-IFN-α2b<1 in genotype 2 and 3 was the best choice saving about 1800-4500€ per SVR (81%).

L'aumento di morbilità e la mortalità per malattie del fegato e, in particolare per il carcinoma epatocellulare (HCC), in tutto il mondo ha comportato la necessaria implementazione di programmi di screening e di strategie sanitarie per la diagnosi precoce e la cura delle epatiti croniche virali. Le ricerche svolte nell’ambito di questo dottorato incentrate sulla cura del paziente con epatite C, si sono articolate su aspetti epidemiologici clinici e sperimentali diretti in particolar modo ad identificare i soggetti a rischio evolutivo e le caratteristiche virologiche più rilevanti nella cura standard dell’epatite C costituita da Peg-IFN e Ribavirina che oggi consente la guarigione di circa la metà dei pazienti. Vengono pertanto presentati 4 studi che hanno riguardato: 1. la caratterizzazione virale dell’infezione nella regione Veneto 2. lo studio sulla stadiazione non-invasiva della fibrosi epatica e confronto di marcatori sierici e tessutali. 3. l’aderenza alla terapia antivirale e sui meccanismi patogenetici della depressione indotta da interferone 4. l’impiego della terapia antivirale nel Veneto: modalità d’uso efficacia e costi. 1. Il primo progetto di ricerca ha riguardato circa 3.000 casi con epatite cronica C, che sono stati sottoposti a controlli periodici in base allo stadio della malattia (epatite cronica e/o cirrosi) e, dove indicato, sottoposti a trattamento antivirale con PEG-IFN alfa e ribavirina allo scopo di eradicare l’infezione. Sono stati eseguiti test virologici a) per determinare il genotipo di HCV con il metodo VERSANT HCV 2.0, INNO-LIPA e b) per il monitoraggio quantitativo di HCV-RNA con metodo COBAS TaqMan Real-Time PCR, range di linearità 43-69.000.000 IU / mL, prima della terapia e 6 mesi dopo l'interruzione del trattamento. L'analisi effettuata ha confrontato la distribuzione dei genotipi in circa duemila casi con infezione virale contratta prima dell’anno 1995 (data di applicazione routinaria dello screening di HCV mediante tecniche di biologia molecolare), rispetto a 978 casi con infezione contratta probabilmente nel periodo successivo. E’ stata riscontrata una diversa prevalenza di genotipi nei casi con infezione prima e dopo il 1995: HCV-1b e HCV-2 globalmente interessavano il 72,8% prima del 1995, mentre rappresentano nel periodo successivo il 62,8% (-10%). Al contrario HCV-1a, HCV-3 e HCV-4 mostrano cumulativamente un aumento del 10% interessando prima del 1995 il 27,2% delle infezioni e il 37,2% nel periodo successivo (p <0.01). Questa osservazione ha confermato la presenza nel tempo di almeno 2 episodi di epidemia caratterizzati; il primo da una popolazione con importante rischio trasfusionale, sesso femminile, età media più avanzata, infezione con HCV-1b e HCV-2 e presenza di cirrosi nel 24% dei casi; il secondo, da soggetti maschi, più giovani, con una storia di abuso di droga, infezione con HCV 1a, HCV-3 e HCV-4 e presenza di cirrosi nel 10%. I livelli di viremia valutati con una ROC-curve hanno mostrato un cut-off di HCV RNA <5.2 log (IU / mL) come il principale fattore predittivo di risposta sostenuta nei pazienti sottopost a terapia antivirale (SVR) con un Odds ratio di circa 6 volte rispetto ai livelli viremici più elevati. 2. Recentemente l'antigene del carcinoma a cellule squamose (SCCA) è stato rilevato nel siero in forma di immunocomplesso con IgM (SCCA-IC) in circa un terzo dei pazienti con epatite cronica e fino a due terzi dei casi con carcinoma epatocellulare. La standardizzazione di metodiche ELISA e di immunoistochimica per la determinazione della SCCA nel siero e nel fegato rende oggi questo biomarcatore molto interessante per la potenziale rilevanza clinica. Questo secondo studio ha valutato la correlazione dei livelli sierici e l’espressione tessutale di SCCA specialmente in relazione al rischio evolutivo istologico da infezione cronica da HCV in 63 pazienti affetti da epatite cronica con attiva replicazione virale (33/30 M / F, età media 48,2 ± 12,2 anni) sottoposti a test biochimici di funzionalità epatica, biopsia epatica con valutazione istologica secondo lo score di Ishak. Sulla base dei reperti istologici la popolazione in studio è stata raggruppata in casi senza (<F3) e con (> F3) fibrosi settale. I livelli sierici di SCCA-IC e l’espressione nel fegato di SCCA hanno mostrato una correlazione statisticamente significativa (p=0.01), inoltre, mediante l’analisi delle ROC-curves è stato identificato un livello di SCCA pari a 190 UA ml, come il migliore cut-off per la discriminazione dei casi senza e con evoluzione fibrotica della malattia epatica. 3. Questo terzo progetto di ricerca ha studiato la prevalenza e la gravità dei sintomi depressivi durante la terapia antivirale per l'epatite C cronica con Peg-IFN-alfa e Ribavirina (RBV), allo scopo di: a) individuare i casi più a rischio di sintomi neuro-psichiatrici confrontando le diverse scale utilizzate per la valutazione iniziale di ansia-depressione ed in particolare tra i test auto- o etero-somministrati, b) correlare gli effetti collaterali neuro-psichiatrici con i livelli sierici di triptofano e chinurenina e c) verificare l’efficacia della terapia antidepressiva con SSRI per controllare l'ansia e la depressione IFN-indotta. Sono stati prospetticamente reclutati 53 pazienti sottoposti ad un ciclo di terapia antivirale con PEG-IFN-alfa 2a o 2b + ribavirina per un periodo di 48 settimane se con genotipo HCV-1-4 e di 24 settimane se con HCV-2-3. Sono stati somministrati i seguenti tests: Mini International Neuropsychiatric Interview, scala di Hamilton per la depressione e ansia, Beck Depression Inventory e Hospital Anxiety and Depression Scale; è stata eseguita la misurazione del triptofano e chinurenina mediante HPLC e i dati ottenuti sono stati valutati con l’analisi statistica per misure ripetute ANOVA. Prima dell’inizio della terapia, 6 casi avevano già una diagnosi di depressione maggiore della malattia (MDD), come definito dal DMS-IV, mentre 14 casi svilupparono una depressione IFN-indotta (IFN-DD) nel corso di 4-24 settimane di terapia e quindi vennero sostenuti con la somministrazione di SSRI. E’ stata registrata una prevalenza di depressione PEG-IFN-indotta (IFN-DD) del 30%. Dopo 4 settimane di terapia, un punteggio di BDI>9 punti ha consentito di discriminare i casi ad alto rischio di IFN-DD che hanno inoltre mostrato una significativa diminuzione del triptofano >2 ug/ml rispetto ai livelli pre-terapia, correlata all’aumento dei livelli di chinurenina e del rapporto KYN/TRP. Il trattamento con SSRI in questi casi ha consentito un miglioramento della QoL e dell’aderenza alla terapia antivirale e anche un incremento dei livelli di triptofano nel siero. 4. L'attuale standard di cura per il trattamento dell'infezione cronica da virus dell'epatite C (HCV) è la terapia di combinazione con Peg-interferone (IFN) alfa-2a o 2b più Ribavirina (RBV). Questo studio ha valutato le modalità del trattamento antivirale nella regione Veneto, in particolare farmaco-utilizzazione e costo-efficacia nella pratica clinica di ogni giorno del trattamento con i 2 Peg-IFN disponibili. Dodici centri epatologici collegati on-line hanno prospetticamente raccolto dati su 450 soggetti sottoposti a terapia antivirale per l'epatite cronica o cirrosi. L’analisi post-hoc dei casi trattati da gennaio 2003 a dicembre 2005 è stata eseguita confrontando 167 casi trattati con Peg-interferone alfa-2a (Pegasys, Roche, a dose fissa di 180μg / settimana) e 288 che hanno ricevuto PEG-IFN alfa-2b (PEG-INTRON, Schering-Plough, con dose di 50-150 μg /settimana) e ribavirina (RBV). Complessivamente la SVR ottenuta con il Peg-IFN-α2a o α2b e RBV è risultata identica (61%), tuttavia i dati di farmaco-utilizzazione hanno mostrato che Peg-IFN-α2b è stato prescritto con un dosaggio sub-ottimale in ben il 58% dei casi con dosi di <1mcg/kg/settimana, mentre il 95% dei casi trattati con PEG-IFN-α2a ha ricevuto la dose piena di 180mcg/settimana. L’analisi di efficacia nei casi trattati con PEG-IFN-α2b<1 ha mostrato una risposta virologica sostenuta inferiore rispetto a quelli trattati con una dose >1mcg/kg/settimana (rispettivamente 50% vs. 66%, p=0,00) ed in particolare, nel caso di genotipo HCV-1-4 (32% vs. 53%, p=0,00). L’analisi di sensibilità ad una via ha indicato che il trattamento con Peg-IFN-α2b>1 o PEG-IFNα2a sono risultati costo-efficaci in caso di infezione da HCV-1-4, mentre Peg-IFN-α2b<1 si è dimostrato il trattamento di scelta in caso di infezione da HCV-2-3 consentendo un risparmio di circa 1.800-4.500€xSVR (81%).