Applicazione della genomica funzionale allo studio di specie di interesse in acquacoltura

In the last 10-15 years, the production of farmed marine fish species has increased rapidly, mainly as a consequence of improved breeding and husbandry methods and technologies. However, severe production bottlenecks, such as high larval mortality, skeletal malformations, susceptibility to stress and disease, remain to be solved. The application of genomic technologies offers much promise to rapidly increase our knowledge on molecular mechanisms underlying key productive traits in farmed species. In the present study, many efforts were invested in order to provide genomic tools for the study of two fish species of great importance for the European aquaculture; the gilthead seabream (Sparus aurata) and the European sea bass (Dicentrarchus labrax¬). To this end, we report here on the development of two oligo DNA microarray for both S. aurata and D. labrax. All the available ESTs from the gilthead sea bream were used to design two longer (60mer) probes for each transcript using Agilent SurePrint™ technology. This microarray platform was then validated to assess its reproducibility and accuracy on two early stages of gilthead sea bream development, respectively one-day and four days old larvae. Correlation between technical replicates was always > 0.99, with strong positive correlation between paired probes. Cross-validation of microarray data was then carried out using quantitative (q)RT-PCR; a statistically significant positive correlation was obtained comparing expression levels for each target gene across all biological replicates. For the European sea bass, probe design was positively completed for 19,035 target transcripts; high levels of reliability, and reproducibility of the microarray platform were confirmed by qPCR validation and biological replicates analysis. The oligo microarray was then applied to profile gene expression in mandibles and whole-heads of fish affected by prognathism, a skeletal malformation that strongly affect sea bass production. Statistical analysis identified 242 transcripts that are significantly down-regulated in deformed individuals compared to normal fish. Functional annotation of significant genes gives new insights on putative mechanisms involved on mandibular prognathism development. In this study we describe also the identification and characterisation of a NITR gene complex D. labrax, encoded in a single genomic region spanning 270 kilo bases (kb). In total, 27 NITR genes and 3 pseudogenes, organized in a tandemly arrayed cluster, were identified. Comparison of the predicted peptide structure across D. labrax NITRs shows considerable variations; these genes maintain the three major genomic organizations that appear to be essentially conserved among fish species along with new features presumably involving processes of intron loss, exon deletion, and acquisition on new exons. Comparative analyses of all published NITR genes suggest that these receptors follow birth-and-death model of gene evolution in which duplication events together with lineage-specific gain and loss of individual members contributed to the rapid diversification of individual gene families

Negli ultimi 10-15 anni, la produzione di specie marine in acquacoltura è cresciuta molto rapidamente; diverse limitazioni, tuttavia, non sono ancora state superate (per es. elevata mortalità larvale, suscettibilità a stress e patologie, sviluppo di malformazioni scheletriche). La genomica funzionale può fornire gli strumenti per una migliore conoscenza dei meccanismi molecolari responsabili di tratti produttivi di forte interesse economico nelle specie allevate. Nel presente studio, numerosi sforzi sono stati investiti allo scopo di sviluppare e sfruttare strumenti di genomica funzionale per lo studio di due specie di primaria importanza per l’acquacoltura europea, l'orata (Sparus aurata) e il branzino (Dicentrarchus labrax¬); di seguito viene riportato lo sviluppo di due piattaforme microarray a oligonucleotidi per entrambe le specie. Tutti i trascritti disponibili di orata sono stati utilizzati per la sintesi di due sonde a oligonucleotidi (60meri) per ciascun trascritto utilizzando la tecnologia Agilent SurePrint™. La riproducibilità e l’accuratezza della piattaforma microarray sono state quindi testate in due stadi precoci di sviluppo di orata: due e quattro giorni dalla schiusa. La correlazione tra le repliche tecniche si è sempre rivelata elevata (r >0,99) e forte correlazione è stata osservata anche tra le coppie di sonde per ciascun trascritto. La Real-time RT-PCR è stata quindi utilizzata per cross-validare i dati di espressione del microarray; anche in questo caso è stata ottenuta una correlazione statisticamente significativa per ciascun gene target in tutte le repliche biologiche. Per il branzino, il disegno delle sonde è stato effettuato per 19.035 trascritti target; l’elevata affidabilità e riproducibilità della piattaforma è stata confermata tramite Real-time RT-PCR e analisi delle repliche biologiche. Il microarray è stato quindi impiegato per analizzare i profili di espressione genica in mandibole e teste di esemplari di branzino affetti da prognatismo, una malformazione scheletrica che ne compromette pesantemente la produzione e la commerciabilità. Analisi statistiche hanno permesso di identificare 242 trascritti sottoespressi negli esemplari prognati rispetto ai controlli; una annotazione funzionale di questi fornisce nuove informazioni sui potenziali meccanismi coinvolti nello sviluppo di questa malformazione. Nel presente studio viene anche descritta l’identificazione e la caratterizzazione, in branzino, dei recettori Novel Immune-type Receptor (NITR). In totale sono stati identificati 27 geni e 3 pseudogeni, organizzati in cluster in una regione genomica di circa 270 kb. I membri di questo cluster sono caratterizzati da una elevata variabilità; i NITR, infatti, mantengono tre organizzazioni genomiche principali, che appaiono conservate in diverse specie di teleostei, oltre a forme nuove che coinvolgono processi di perdita di introni, delezioni di esoni o loro nuova acquisizione. Analisi comparative tra tutti i geni NITR finora noti sembrano suggerire che questi seguano il modello evolutivo noto col nome di “birth-and-death”, nel quale eventi di duplicazione, assieme alle perdite/acquisizioni di singoli membri, contribuiscono alla rapida evoluzione di diverse famiglie geniche.