The elusive function of the cellular prion protein (PrPC) hampers the understanding of the molecular mechanism at the basis of prion diseases, and the development of suitable therapeutic protocols. Use of cell model systems, and genetically modified animals, have nevertheless suggested a number of potential roles for the protein, ranging from protecting against oxidative stress to cell differentiation. Because we now know that muscle is involved in PrPC pathophysiology, we have considered intact heart paradigms for the in situ study of the cell-protecting function of PrPC. Isolated muscle organs retain the cell native environment and are also more suitable to experimental designs than whole animals. Accordingly, by taking advantage of mice expressing different PrPC amounts (wild type (WT), knock-out (KO) and overexpressors (OE)), the protection of PrPC against cell oxidative injuries was investigated in isolated hearts subjected to ischemia/reperfusion and perfusion protocols that involve oxidative stress. In line with the putative capability of PrPC to antagonize oxidative injury and cell death mechanisms, our prediction was that hearts from PrPC-KO adult mice manifest an overt phenotype after ischemic challenge, resulting in exacerbation of heart oxidative damage. Conversely, PrPC-OE mice should demonstrate a higher resistance over reactive oxygen species (ROS) production. We found that PrPC-OE hearts were more protected from the damage induced by post-ischemic reperfusion than WT and PrPC-KO hearts, as indicated by reduced cell death and decreased oxidation of myofibrillar protein and accumulation of ROS. We then reasoned that, if indeed PrPC acts as an antioxidant, absence of PrPC should increase the effect of ischemic preconditioning (IPC), in contrast to the less evident protection in hearts from PrPC-OE mice. Our data on hearts subjected to IPC nicely fitted with this prediction, given that IPC led to a strong decrease of damage in PrPC-KO hearts, an intermediate protection in WT hearts, and no significant effect in PrPC-OE hearts. We also applied protocols of non-ischemic oxidative injury, by subjecting isolated hearts to perfusion with hydrogen peroxide. Such treatment was associated with a significantly larger myocardial cell loss and myofibrillar oxidative damage PrPC-KO hearts, compared to hearts from WT and PrPC-OE mice. We then investigated the possible modulation by PrPC of proteins involved in the oxidative stress response. We performed enzymatic activity assays on catalase (CAT) and mitochondrial and cytosolic superoxide dismutase (SOD): we found a decrease in CAT activity in PrPC-KO hearts with respect to PrPC-expressing counterparts, whereas no major variation in the activity/expression of SOD was registered among the different PrPC-genotypes. In addition, we found increased levels of both total and mitochondrial p66Shc, a protein involved in oxidative stress-mediated apoptosis, in hearts lacking PrPC. This unprecedented and intriguing finding demands further investigations in the future. This data thus supports both the value of the in situ muscle paradigm for studying the physiologic function of PrPC, and the role of PrPC against oxidative insults and cell damage.

L’esatto ruolo che la proteina prionica cellulare (PrPC) svolge nella fisiologia della cellula è ancora incerto, e questo impedisce la comprensione dei meccanismi che stanno alla base delle malattie da prione e lo sviluppo di opportune strategie terapeutiche. Studi condotti su modelli cellulare e animali geneticamente modificati, tuttavia, hanno suggerito che PrPC possa svolgere un ruolo protettivo nei confronti dello stress ossidativo e di segnali di morte cellulare. PrPC è particolarmente abbondante nel sistema nervoso centrale, ma è espressa a livelli elevati anche nei tessuti muscolari. Inoltre, recenti evidenze hanno correlato la proteina alla fisiopatologia muscolare. Per questo motivo, abbiamo orientato la nostra ricerca sull’utilizzo di cuori isolati e perfusi, un paradigma sperimentale innovativo per lo studio in situ delle funzioni protettive della PrPC. Rispetto alle cellule in coltura, i cuori isolati hanno il vantaggio di mantenere l’ambiente cellulare di origine e sono inoltre modelli più adatti dell’animale intero per le manipolazioni sperimentali. Di conseguenza, servendoci di topi wild-type (WT) e geneticamente modificati, esprimenti differenti quantità di PrPC (knock-out (KO) e sovra-esprimenti (OE) la proteina), abbiamo verificato la putativa funzione antiossidante di PrPC servendoci di cuori isolati sottoposti a protocolli di ischemia/riperfusione (I/R), o di perfusione, che implicano lo stress ossidativo. La nostra previsione, in linea con la putativa capacità di PrPC di contrastare l’insulto ossidativo ed i meccanismi di morte cellulare, era che i cuori espiantati da topi PrPC-KO e da topi PrPC-OE, e sottoposti a protocolli di I/R, manifestassero, rispettivamente, una maggiore e minore sensibilità al danno rispetto alla controparte WT. Quello che abbiamo rilevato è che i cuori PrPC-OE sono più resistenti al danno indotto dalla riperfusione post-ischemica rispetto a cuori WT e PrPC-KO, come indicato dalla riduzione di morte cellulare, ossidazione di proteine miofibrillari ed accumulo di specie reattive dell’ossigeno (ROS). Abbiamo quindi ipotizzato che, se realmente PrPC agisse come un agente anti-ossidante, l’assenza della proteina avrebbe potuto aumentare la protezione conferita dall’utilizzo di un protocollo di pre-condizionamento ischemico (IPC), il cui meccanismo si basa sulla produzione di piccole quantità di ROS. Questa ipotesi si è dimostrata corretta, dato che il protocollo di IPC svolge un forte ruolo protettivo nei cuori PrPC-KO, uno intermedio nei WT, e nessun effetto nei cuori PrPC-OE. Abbiamo inoltre applicato protocolli basati su un tipo di danno ossidativo non ischemico, perfondendo i cuori isolati con perossido di idrogeno. Tale trattamento produce una maggiore morte cellulare ed una maggiore ossidazione delle proteine miofibrillari nei cuori PrPC-KO, paragonati a quelli WT e PrPC-OE. Abbiamo infine ipotizzato un possibile ruolo di PrPC nella modulazione dell’attività/espressione di proteine coinvolte nella risposta agli stimoli ossidativi. A tal fine, abbiamo testato l’attività, in cuori non perfusi, di alcuni enzimi scavenger di ROS, tra cui catalasi (CAT) e superossido dismutasi (SOD) mitocondriale e citosolica. Mentre abbiamo osservato una riduzione significativa dell’attività di CAT nei cuori PrPC-KO rispetto a quelli esprimenti PrPC, l’espressione e l’attività delle SOD non sono risultate differenti nei tre genotipi di PrPC. Da sottolineare, infine, che è stato dimostrato un aumento dell’espressione di p66Shc, una proteina coinvolta nella mediazione di segnali pro-apoptotici, nei cuori privi PrPC. Tale osservazione, assolutamente inedita, meriterà ulteriori approfondimenti futuri. I nostri risultati supportano dunque sia il valore del nuovo modello sperimentale in situ per lo studio della funzione fisiologica di PrPC, sia il coinvolgimento della proteina nelle difese contro lo stress ossidativo ed il danno cellulare.

Intact hearts: a new tool for elucidating the antioxidant role of the prion protein / Zanetti, Filippo. - (2010 Jan 29).

Intact hearts: a new tool for elucidating the antioxidant role of the prion protein

Zanetti, Filippo
2010

Abstract

L’esatto ruolo che la proteina prionica cellulare (PrPC) svolge nella fisiologia della cellula è ancora incerto, e questo impedisce la comprensione dei meccanismi che stanno alla base delle malattie da prione e lo sviluppo di opportune strategie terapeutiche. Studi condotti su modelli cellulare e animali geneticamente modificati, tuttavia, hanno suggerito che PrPC possa svolgere un ruolo protettivo nei confronti dello stress ossidativo e di segnali di morte cellulare. PrPC è particolarmente abbondante nel sistema nervoso centrale, ma è espressa a livelli elevati anche nei tessuti muscolari. Inoltre, recenti evidenze hanno correlato la proteina alla fisiopatologia muscolare. Per questo motivo, abbiamo orientato la nostra ricerca sull’utilizzo di cuori isolati e perfusi, un paradigma sperimentale innovativo per lo studio in situ delle funzioni protettive della PrPC. Rispetto alle cellule in coltura, i cuori isolati hanno il vantaggio di mantenere l’ambiente cellulare di origine e sono inoltre modelli più adatti dell’animale intero per le manipolazioni sperimentali. Di conseguenza, servendoci di topi wild-type (WT) e geneticamente modificati, esprimenti differenti quantità di PrPC (knock-out (KO) e sovra-esprimenti (OE) la proteina), abbiamo verificato la putativa funzione antiossidante di PrPC servendoci di cuori isolati sottoposti a protocolli di ischemia/riperfusione (I/R), o di perfusione, che implicano lo stress ossidativo. La nostra previsione, in linea con la putativa capacità di PrPC di contrastare l’insulto ossidativo ed i meccanismi di morte cellulare, era che i cuori espiantati da topi PrPC-KO e da topi PrPC-OE, e sottoposti a protocolli di I/R, manifestassero, rispettivamente, una maggiore e minore sensibilità al danno rispetto alla controparte WT. Quello che abbiamo rilevato è che i cuori PrPC-OE sono più resistenti al danno indotto dalla riperfusione post-ischemica rispetto a cuori WT e PrPC-KO, come indicato dalla riduzione di morte cellulare, ossidazione di proteine miofibrillari ed accumulo di specie reattive dell’ossigeno (ROS). Abbiamo quindi ipotizzato che, se realmente PrPC agisse come un agente anti-ossidante, l’assenza della proteina avrebbe potuto aumentare la protezione conferita dall’utilizzo di un protocollo di pre-condizionamento ischemico (IPC), il cui meccanismo si basa sulla produzione di piccole quantità di ROS. Questa ipotesi si è dimostrata corretta, dato che il protocollo di IPC svolge un forte ruolo protettivo nei cuori PrPC-KO, uno intermedio nei WT, e nessun effetto nei cuori PrPC-OE. Abbiamo inoltre applicato protocolli basati su un tipo di danno ossidativo non ischemico, perfondendo i cuori isolati con perossido di idrogeno. Tale trattamento produce una maggiore morte cellulare ed una maggiore ossidazione delle proteine miofibrillari nei cuori PrPC-KO, paragonati a quelli WT e PrPC-OE. Abbiamo infine ipotizzato un possibile ruolo di PrPC nella modulazione dell’attività/espressione di proteine coinvolte nella risposta agli stimoli ossidativi. A tal fine, abbiamo testato l’attività, in cuori non perfusi, di alcuni enzimi scavenger di ROS, tra cui catalasi (CAT) e superossido dismutasi (SOD) mitocondriale e citosolica. Mentre abbiamo osservato una riduzione significativa dell’attività di CAT nei cuori PrPC-KO rispetto a quelli esprimenti PrPC, l’espressione e l’attività delle SOD non sono risultate differenti nei tre genotipi di PrPC. Da sottolineare, infine, che è stato dimostrato un aumento dell’espressione di p66Shc, una proteina coinvolta nella mediazione di segnali pro-apoptotici, nei cuori privi PrPC. Tale osservazione, assolutamente inedita, meriterà ulteriori approfondimenti futuri. I nostri risultati supportano dunque sia il valore del nuovo modello sperimentale in situ per lo studio della funzione fisiologica di PrPC, sia il coinvolgimento della proteina nelle difese contro lo stress ossidativo ed il danno cellulare.
29-gen-2010
The elusive function of the cellular prion protein (PrPC) hampers the understanding of the molecular mechanism at the basis of prion diseases, and the development of suitable therapeutic protocols. Use of cell model systems, and genetically modified animals, have nevertheless suggested a number of potential roles for the protein, ranging from protecting against oxidative stress to cell differentiation. Because we now know that muscle is involved in PrPC pathophysiology, we have considered intact heart paradigms for the in situ study of the cell-protecting function of PrPC. Isolated muscle organs retain the cell native environment and are also more suitable to experimental designs than whole animals. Accordingly, by taking advantage of mice expressing different PrPC amounts (wild type (WT), knock-out (KO) and overexpressors (OE)), the protection of PrPC against cell oxidative injuries was investigated in isolated hearts subjected to ischemia/reperfusion and perfusion protocols that involve oxidative stress. In line with the putative capability of PrPC to antagonize oxidative injury and cell death mechanisms, our prediction was that hearts from PrPC-KO adult mice manifest an overt phenotype after ischemic challenge, resulting in exacerbation of heart oxidative damage. Conversely, PrPC-OE mice should demonstrate a higher resistance over reactive oxygen species (ROS) production. We found that PrPC-OE hearts were more protected from the damage induced by post-ischemic reperfusion than WT and PrPC-KO hearts, as indicated by reduced cell death and decreased oxidation of myofibrillar protein and accumulation of ROS. We then reasoned that, if indeed PrPC acts as an antioxidant, absence of PrPC should increase the effect of ischemic preconditioning (IPC), in contrast to the less evident protection in hearts from PrPC-OE mice. Our data on hearts subjected to IPC nicely fitted with this prediction, given that IPC led to a strong decrease of damage in PrPC-KO hearts, an intermediate protection in WT hearts, and no significant effect in PrPC-OE hearts. We also applied protocols of non-ischemic oxidative injury, by subjecting isolated hearts to perfusion with hydrogen peroxide. Such treatment was associated with a significantly larger myocardial cell loss and myofibrillar oxidative damage PrPC-KO hearts, compared to hearts from WT and PrPC-OE mice. We then investigated the possible modulation by PrPC of proteins involved in the oxidative stress response. We performed enzymatic activity assays on catalase (CAT) and mitochondrial and cytosolic superoxide dismutase (SOD): we found a decrease in CAT activity in PrPC-KO hearts with respect to PrPC-expressing counterparts, whereas no major variation in the activity/expression of SOD was registered among the different PrPC-genotypes. In addition, we found increased levels of both total and mitochondrial p66Shc, a protein involved in oxidative stress-mediated apoptosis, in hearts lacking PrPC. This unprecedented and intriguing finding demands further investigations in the future. This data thus supports both the value of the in situ muscle paradigm for studying the physiologic function of PrPC, and the role of PrPC against oxidative insults and cell damage.
Prion protein, heart, oxidative stress, ischemia, perfusion
Intact hearts: a new tool for elucidating the antioxidant role of the prion protein / Zanetti, Filippo. - (2010 Jan 29).
File in questo prodotto:
File Dimensione Formato  
Filippo_Zanetti.pdf

accesso aperto

Tipologia: Tesi di dottorato
Licenza: Non specificato
Dimensione 3.07 MB
Formato Adobe PDF
3.07 MB Adobe PDF Visualizza/Apri
Pubblicazioni consigliate

I documenti in IRIS sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.

Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/11577/3426961
Citazioni
  • ???jsp.display-item.citation.pmc??? ND
  • Scopus ND
  • ???jsp.display-item.citation.isi??? ND
social impact