PRESENILINS AND Ca2+ HOMEOSTASIS: ROLE IN ALZHEIMER'S DISEASE AND CELL PHYSIOLOGY

Alzheimer's Disease (AD) is a progressive neurodegenerative disorder and the most common form of senile dementia. The characteristic histopathological hallmarks of AD are the intracellular neurofibrillary tangles and the amyloid plaques, made of aggregated amyloid peptides (Aβ), that deposit in the extracellular matrix of the brain. Aβ peptides are the result of two sequential cleavages of the amyloid precursor protein (APP); Aβ is eventually released by the γ-secretase enzyme. The most abundant Aβ peptide species, both physiologically produced throughout life, are Aβ40 and Aβ42, which is more insoluble and aggregation-prone. Although most AD cases are sporadic, a small percentage of patients is affected by the hereditary form of AD (Familial Alzheimer's Disease, FAD), caused by dominant mutations in one of three genes. These genes code for the APP, presenilin-1 (PS1) and presenilin-2 (PS2); PSs are the catalytic subunits of the γ-secretase enzyme complex. FAD-linked mutations in PSs lead to an increased Aβ42/Aβ40 ratio, that promotes Aβ plaques deposition. Beside this effect on Aβ production, many mutations in PS1 and PS2 have been extensively demonstrated to cause alterations in the intracellular Ca2+ homeostasis, thus making neurons more sensitive to excitotoxic stimuli and apoptosis. Nevertheless, the effects and the mechanisms of this interference in the Ca2+ balance are still unclear and under intense investigation. For a long time, the most popular hypothesis has been the "Ca2+ overload" hypothesis, which claims that mutated PSs give rise to exaggerated Ca2+ responses upon stimulation, sustained by intracellular stores, and the endoplasmic reticulum (ER) in particular, overloaded with Ca2+. However, an increasing number of studies has recently began to critically question this hypothesis and different possible targets of PSs action have been proposed. Previous works from our laboratory showed that a number of FAD-linked PS1 and PS2 mutants reduce the ER Ca2+ content; starting from this evidence, we investigated the mechanism(s) leading to this effect. The SERCA-2 pump was identified as the most likely target of FAD-linked PS2-T122R action and indeed the two protein interact, as co-immunoprecipitation assays demonstrated. PS2-T122R was shown to impair the pump activity by decreasing its maximal Ca2+ uptake rate, while leaving its protein level unaltered. Interestingly, similar results were obtained with wild-type (wt) PS2: transient expression of wt PS2 in a PSs null background led to a lower steady-state ER Ca2+ concentration and a slower ER Ca2+ uptake rate. Consistently with this observation, knocking down the endogenous PS2 level by small interefering RNAs increased both parameters. These results suggest a physiological role for PS2 in regulating intracellular Ca2+ handling, acting as a brake for the SERCA pumps. Finally, over-expression of SERCA-2B together with PS2-T122R rescued the ER Ca2+ content and the pump uptake rate at the respective values observed in control cells. A long-term goal of the project is studying intracellular Ca2+ dynamics, both in vitro and in vivo, in the brain of AD mouse models based on APP and FAD-linked PS mutants, through single cell live Ca2+ imaging experiments with FRET-based cameleon Ca2+ probes. Thus, the second part of this work has been dedicated to a preliminary set up of the suitable experimental conditions to be employed with two cameleon sensors genetically targeted to the lumen of the ER and the Golgi apparatus. While the results obtained with the ER-targeted cameleon probe matched those previously obtained with an ER-targeted aequorin probe, an unexpected result was obtained with a novel cameleon localized to a specific sub-compartment of the Golgi apparatus. This new sensor helped us to better define the mechanism of action of PS2-T122R, showing that it selectively acts on SERCA-2 but not on SPCA-1 pumps.

La malattia di Alzheimer (Alzheimer's Disease, AD) è una patologia neurodegenerativa progressia e rappresenta la forma più comune di demenza senile. Le caratteristiche istopatologiche dell'AD sono le fibrille intraneuronali e le placche amiloidi, formate da aggregati di peptidi amiloidi (Aβ), che si depositano nella matrice extracellulare del cervello. I peptidi Aβ sono il prodotto di due tagli sequenziali della proteina precursore dell'amiloide (amyloid precursor protein, APP). L'ultimo taglio proteolitico di APP, che porta al rilascio degli Aβ nella matrice extracellulare, è opera dell'enzima γ-secretasi. Le forme più abbondanti di peptidi Aβ, entrambe fisiologicamente prodotte nel corso della vita, sono Aβ40 e Aβ42, che è più insolubile e incline ad aggregare. Sebbene la maggioranza dei casi di AD sia di origine sporadica, una piccola percentuale di pazienti è affetta dalla forma ereditaria di AD (Familial Alzheimer's Disease, FAD), causata da mutazioni dominanti in uno dei tre geni che codificano per l'APP, per la presenilina-1 (PS1) e la presenilina-2 PS2). Le preseniline (PSs) sono le subunità  catalitiche del complesso enzimatico dellaγ-secretasi. Mutazioni associate a FAD nelle PSs portano ad un aumento del rapporto Aβ40/Aβ42, che favorisce il depositarsi delle placche amiloidi. Oltre a questo effetto sulla produzione di Ab, è stato ampiamente dimostrato che molte mutazioni nelle PS1 e PS2 causano alterazioni nell'omeostasi intracellulare del Ca2+, rendendo così i neuroni più sensibili a stimoli eccitotossici e all'apoptosi. Ciò nonostante, gli effetti e i meccanismi di questa interferenza nel normale equilibrio intracellulare del Ca2+ sono ancora poco chiari e oggetto di intensa indagine. A lungo, l'ipotesi più popolare è stata l'ipotesi del "sovraccarico di Ca2+", la quale afferma che le PSs mutate danno origine a esagerate risposte Ca2+ in seguito a stimolazione, sostenute da depositi intracellulari (in particolare, il reticolo endoplasmatico, ER) sovraccarichi di Ca2+. Tuttavia, un crescente numero di studi ha di recente iniziato a mettere in discussione questa ipotesi e diversi possibili bersagli dell'azione delle PSs sono stati proposti. Studi precedenti condotti nel nostro laboratorio hanno mostrato che un certo numero di PS1 e PS2 mutate associate a FAD riducono il contenuto di Ca2+ dell'ER; partendo da queste osservazioni, abbiamo indagato il/i meccanismo/i alla base di questo effetto. La pompa SERCA-2 è stata identificata come il bersaglio più probabile dell'azione della mutazione associata a FAD T122R nella PS2 (PS2-T122R) e infatti le due proteine, SERCA-2 e PS2-T122R, interagiscono, come dimostrato da esperimenti di co-immunoprecipitazione. E' stato dimostrato che la PS2-T122R danneggia l'attività della pompa riducendo la sua velocità  massima di trasporto, mentre il livello della proteina rimane inalterato. E' interessante notare, inoltre, che risultati simili sono stati ottenuti con la PS2 non mutata (wild-type, wt): l'espressione transiente della PS2 wt in un modello cellulare privo di PSs ha avuto come conseguenze un abbassamento della concentrazione di Ca2+ nell'ER all'equilibrio e un rallentamento della velocità di importo del Ca2+ nell'ER. Coerentemente con questa osservazione, l'abbattimento dell'espressione della PS2 endogena mediante la tecnica di RNA interference ha portato ad un incremento di entrambi questi parametri. Questi risultati suggeriscono un ruolo fisiologico della PS2 nella regolazione intracellulare del Ca2+; la PS2 agirebbe come un freno per le pompe SERCA. Infine, la sovra-espressione della SERCA-2B assieme alla PS2-T122R ha permesso di riportare i valori del contenuto di Ca2+ nell'ER e della velocità della pompa ai valori di controllo. Uno degli obiettivi a lungo termine di questo progetto è studiare le dinamiche intracellulari del Ca2+, sia in vivo che in vitro, nel cervello di topi transgenici usati come modello di AD, in quanto basati su mutazioni nell'APP e in PS associate a FAD. L'approccio scelto è monitorare le variazioni di Ca2+ in singola cellula attraverso sonde per il Ca2+ basate su FRET, i cameleons. Pertanto, la seconda parte di questo lavoro è stata dedicata alla messa a punto preliminare delle condizioni sperimentali più adatte da adottare con due sonde cameleons, geneticamente indirizzate nel lume dell'ER e dell'apparato di Golgi. Mentre i risultati ottenuti con il cameleon indirizzato all'ER corrispondono a quelli ottenuti in precedenza con un'equorina indirizzata all'ER, un risultato inaspettato è emerso utilizzando un nuovo cameleon localizzato in uno specifico compartimento del Golgi. Questa nuova sonda ci ha aiutato a definire meglio il meccanismo di azione della PS2-T122R, mostrando che agisce selettivamente sulle pompe SERCA-2 ma non sulle pompe SPCA1.