PRESENILIN-2 AND CALCIUM HANDLING IN FAMILIAL ALZHEIMER'S DISEASE: A GENETICALLY ENCODED Ca2+ PROBES-BASED STUDY ROLE OF PS2 STRUCTURE, ER Ca2+-LEAK PATHWAYS AND ER-MITOCHONDRIA INTERPLAY

Calcium (Ca2+) is a key second messenger in living cells and it regulates a multitude of cell functions; this means as well that a dysregulation in its signaling cascade can be detrimental for cell fate. Ca2+ mishandling has been proposed as a causative mechanism for most neurodegenerative diseases and in particular for Alzheimer’s Disease (AD). From the middle ‘80s, alterations in Ca2+ dynamics were noticed in fibroblasts from AD patients, but extensive studies on AD and Ca2+ homeostasis started only after the identification of mutations linked to Familial Alzheimer’s Disease (FAD) in three genes, app, psen-1 and psen-2, coding for Amyloid Precursors Protein (APP), Presenilin-1 and Presenilin-2 (PS1, PS2). Mutations in these genes caused alterations in the cleavage of APP by a PS1- or PS2- containing enzyme, thus leading to an increase in the ratio between the two main peptides finally derived from APP maturation, called Ab40 and Ab42, in favor of the latter, the most toxic and most prone to aggregation specie; this in turn would increase the deposition of “Amyloid Plaques”, one of the principal histopathological feature of AD. Up to now, the generation of Ab42 peptides, its oligomers and finally amyloid plaques is the core of the most widely accepted pathogenic hypothesis for AD, the “Amyloid Cascade Hypothesis”. Considering Ca2+ homeostasis, most of the attention has been paid to the effect of PS1 (and only lately of PS2) mutations. Initially, most works reported an increase in the Ca2+ released in the cytosolic compartment from ER upon stimulation in cells expressing FADPS( 1), thus suggesting an increase in ER Ca2+ loading, the “Ca2+ Overload Hypothesis”. Although supported by several groups for many years, this hypothesis has never been undisputedly accepted, since some data were clearly in contrast with it, especially those considering PS2 mutations. Recently a strong evidence in support of “Ca2+ overload hypothesis” came from works suggesting that wt PSs can form low conductance Ca2+ channels in the ER membrane, providing most of the constitutive Ca2+ leak from the organelle; this function would be compromised by FAD mutations, that would thus lead to an ER Ca2+ overload. Again, these data have not been collectively accepted and other groups provided alternative explanations for the enhanced Ca2+ release in FAD-PSs (mostly PS1) expressing cells, such as enhanced Ryanodine Receptor (RyR) activation, augmented IP3 Receptor (IP3R) opening probability or potentiated SERCA activity. Interestingly, some of these data were no more suggesting an increased ER Ca2+ content (and so what is properly named “Ca2+ overload”) but rather an exaggerated Ca2+ release from the store, with unchanged (or even reduced) ER Ca2+ concentration. The effect of PS2 mutations has been less studied and is more controversial. Fibroblasts from patients bearing PS2 mutations showed reductions in Ca2+ release upon stimulation and actually data obtained by employing ER-targeted Ca2+ probes (e.g. ER-targeted aequorin) in FAD-PS2 stable clones, as well as cell lines transiently-transfected with different FAD-PS2 mutations, showed a reduction in ER Ca2+ concentration. Starting from these results, demonstrating that the expression of PS2 bearing FAD-linked mutations dampens the intracellular Ca2+ stores, the molecular mechanisms behind this phenomenon have been taken under investigation. In particular, three different aspects of PS2 effect on Ca2+ handling have been analyzed, mostly employing organelle-targeted aequorin Ca2+ probes: (i) the role of PS2 conformation on its effect in reducing the ER Ca2+ level; PSs are in fact synthesized as holoprotein but soon after their incorporation into g-secretase complex undergo a maturation cleavage to their active, dimeric form; ii) the involvement of the Ca2+ leak pathway across the ER membrane in PS2’s effect and more specifically of three different possible leak pathways proposed by literature, RyR, IP3R and the Ribosomal-Translocon complex (RTC); (iii) the role of PS2 in regulating the interplay between ER and mitochondria, a critical feature in cell life. Experiments on cells devoid of endogenous PS1 and PS2 and transfected with different PS2 constructs (resulting in the expression of the full length PS2, the dimeric PS2 or both) demonstrated that the full length conformation of this protein is necessary for the reduction in ER Ca2+ level linked to its expression; moreover, it has been shown that increasing, by different approaches, the endogenous level of the full length PS2 decreases ER Ca2+ content. Data aimed at measuring the decay rate of ER Ca2+ in control cells compared with FADPS2 expressing cells revealed an increased Ca2+ leak in the latter, and so the possible involvement of RyR, IP3R and RTC was investigated both by pharmacological (application of RyR inhibitor Dantrolene, IP3R antagonist Heparin, RTC opener/closer Puromycin/Anisomycin) or genetic (siRNA against IP3R-1 and -3 isoforms) approaches, showing that the PS2-induced ER Ca2+ reduction is at least partially mediated by RyR and IP3R, but not by RTC. Mitochondrial uptake of Ca2+ released from ER was evaluated. When mitochondrial Ca2+ peaks were measured in PS2-expressing and control cells in a condition in which their cytosolic peaks were comparable (by partially pre-emptying control cells), an increase in mitochondrial Ca2+ uptake was observed for cells over-expressing PS2 wt and, more prominently, FAD-PS2. This was not due to a direct effect of PS2 on mitochondrial uptake machinery but to an increased interaction between these organelles and the ER, as demonstrated by evaluating the two organelles proximity by confocal microscopy. By downregulating PS2 with siRNA, it was also shown that endogenous PS2 can control ERmitochondria interaction. These results were confirmed by employing FRET-based “Cameleon” cytosolic and mitochondrial Ca2+ probes on single-cells experiments. Altogether these findings provide new insights into the PS2 effect on Ca2+ homeostasis in Familial Alzheimer’s Disease and, more specifically, on the role of PS2 conformation and on the involvement of RyR and IP3R in its effect. A new aspect of the PS2 control of cell (and in particular Ca2+) dynamics is also emerging since it is here shown, for the first time, that this protein can influence the interplay between ER and mitochondria and that FAD-mutations affect this interaction, opening new directions for the investigation of the effects of PSs’ mutations in Familial Alzheimer’s Disease.

Il calcio (Ca2+) è un secondo messaggero chiave nelle cellule e regola una moltitudine di funzioni cellulari; questo significa che una dis-regolazione nella sua cascata di trasduzione del segnale può essere deleteria per il destino della cellula. Difetti nella regolazione del Ca2+ sono stati proposti come possibili cause della maggior parte delle malattie neurodegenerative e in particolare della Malattia di Alzheimer (AD). Sin dalla metà degli anni ’80 furono notate alterazioni nelle dimamiche intracellulari del Ca2+ in fibroblasti ottenuti da pazienti affetti da AD, ma studi sistematici sulla relazione tra AD e omeostasi del Ca2+ cominciarono solo dopo l’identificazione di mutazioni legate alle forme familiari di AD (FAD) a carico di tre geni, app, psen-1 e psen-2, codificanti per la Proteina Precursone dell’Amiloide (APP), Presenilina-1 e Presenilina-2 (PS1, PS2). Mutazioni in questi geni causano alterazioni nel taglio di APP ad opera di un enzima contenente PS1 o PS2, le quali comportano quindi un aumento nel rapporto tra i due principali peptidi derivanti dalla maturazione di APP, chiamati Ab40 e Ab42, in favore di quest’ultimo, la specie più tossica e con maggiore tendenza all’aggregazione; questo d’altra parte aumenta la deposizioni delle “Placche Amiloidi”, una delle caratteristiche istopatologiche dell’AD. Attualmente, la generazione dei peptidi Ab42, dei suoi oligomeri e infine delle placche amiloidi è alla base della principale ipostesi sulla patogenesi dell’AD, l’“Amyloid Cascade Hypothesis”. Riguardo l’omeostasi del Ca2+, la maggior parte dell’attenzione è stata rivolta all’effetto delle mutazioni in PS1 (e solo successivamente in PS2). Inizialmente la maggior parte dei lavori riportava un incremento degli aumenti citosolici di Ca2+ indotti dalla stimolazione del rilascio dal reticolo endoplasmatico (ER) in cellule esprimenti mutazioni in PS1 associate a FAD (FAD-PS1), e perciò suggerivano un aumento nel contenuto di Ca2+ del ER, “Ca2+ Overload Hypothesis”. Nonostante sia stata sostenuta da molti gruppi per diversi anni questa ipotesi non è mai stata indiscutibilmente accettata, poiché esistevano alcuni dati evidentemente in contrasto con essa, soprattutto considerando mutazioni a carico di PS2. Recentemente l’ipotesi del “Ca2+ Overload” ha ricevuto forte supporto dalla dimostrazione che le PS nella loro forma wild type (wt) formano canali a bassa conduttanza per il Ca2+ nella membrana del ER, rappresentando la maggior parte della via di fuga (leak) costitutiva del Ca2+ dallo stesso organulo; questa funzione sarebbe compromessa dalle mutazioni associate a FAD, che quindi porterebbero ad un sovraccarico di Ca2+ nel ER. Anche in questo caso, questi dati non sono stati universalmente accettati e altri gruppi hanno fornito spiegazioni alternative all’aumentato rilascio di Ca2+ nelle cellule esprimenti mutazioni associate a FAD a carico delle PS (soprattutto PS1), cioè un’aumentata attivazione del Recettore Rianodinico (RyR), una maggiore probabilità di apertura del Recettore dell’IP3 (IP3R) o un potenziamento dell’attività della Ca2+-ATPasi del ER (SERCA). È interessante osservate che alcuni di questi dati non riportano più un aumento nel contenuto di Ca2+ del ER (cioè quello che è propriamente definito “Ca2+ Overload”) ma piuttosto un rilascio esagerato di Ca2+ dallo stesso deposito, con una concentrazione al suo interno inalterata o persino diminuita. L’effetto delle mutazioni in PS2 è stato meno studiato ed è più dibattuto. Fibroblasti ottenuti da pazienti affetti da mutazioni FAD in PS2 hanno rivelato un ridotto rilascio di Ca2+ dal ER in seguito a stimolazione, e dati ottenuti utilizzando sonde in grado di misurare direttamente la concentrazione di Ca2+ nel ER (in particolare basate su equorina modificata indirizzata al ER) hanno dimostrato una diminuzione nella concentrazione di Ca2+ nel ER sia in cloni stabili che in linee cellulari esprimenti mutazioni FAD in PS2. A partire da questi risultati, i quali dimostrano che l’espressione di PS2 recanti mutazioni associate a FAD riduce il contenuto di Ca2+ dei depositi intracellulari, si è deciso di investigare i meccanismi molecolari alla base di questo fenomeno. In particolare, sono stati investigati, soprattutto mediante l’impiego di equorine indirizzate a diversi compartimenti cellulari, tre diversi aspetti dell’effetto di PS2 sull’omeostasi del Ca2+: i) il ruolo della conformazione di PS2 nel suo effetto di riduzione del livello di Ca2+ del ER; le PS sono infatti sintetizzate come proteine intere ma subiscono rapidamente una maturazione mediante taglio ad una forma dimerica quando sono incorporate nel complesso g- secretasico; ii) il coinvolgimento del leak di Ca2+ attraverso la membrane del ER nell’effetto di PS2, e più in particolare di tre diverse possibili “vie di fuga” suggerite in letteratura, RyR, IP3R e il complesso Ribosoma-Traslocone (RTC); iii) il ruolo di PS2 nell’interazione tra ER e mitocondri, un aspetto centrale nella fisiologia della cellula. Esperimenti su cellule prive di PS1 e PS2 endogene transfettate con diversi costrutti di PS2 (in grado di dare l’espressione di PS2 intera, dimerica o di entrambe) hanno dimostrato che la sua conformazione intera è necessaria per la riduzione del contenuto di Ca2+ del ER indotta da PS2; inoltre, è stato dimostrato che un aumento nel livello endogeno di PS2 intera diminuisce il livello di Ca2+ nel ER. Dati mirati a misurare la velocità di uscita del Ca2+ attraverso la membrana del ER hanno evidenziato un leak di ioni Ca2+ aumentato in cellule esprimenti PS2 associate a FAD rispetto ai controlli, e quindi si è investigato il possibile coinvolgimento di RyR, IP3R e RTC sia con approcci di tipo farmacologico (impiego dell’inibitore di RyR Dantrolene, dell’antagosista di IP3 Eparina, di Puromicina e Anisomicina, due agenti che bloccano RTC in conformazione aperta o chiusa rispettivamente) che di tipo genetico (siRNA contro le isoforme 1 e 3 di IP3R al fine di diminuirne il livello proteico), arrivando a dimostrare che la riduzione del contenuto di Ca2+ del ER indotta da PS2 è almeno parzialmente mediata da RyR e IP3R ma non da RTC. È stato inoltre valutato l’accumulo da parte dei mitocondri del Ca2+ rilasciato dal ER. Quando sono stati misurati i picchi di Ca2+ mitocondriale in cellule esprimenti PS2 e cellule di controllo in condizioni in cui il rilascio citosolico era confrontabile (le cellule di controllo venivano parzialmente pre-svuotate) si è osservato un aumento nella captazione di Ca2+ da parte dei mitocondri in cellule esprimenti PS2 wt e, in modo più pronunciato, PS2 associata a FAD. Questo fenomeno non è dovuto a un effetto diretto di PS2 sul meccanismo di ingresso di Ca2+ nei mitocondri, bensì ad un aumento nell’interazione tra i mitocondri stessi e il ER, come è stato dimostrato misurando la prossimità dei due organuli mediante microscopia confocale. L’abbattimento dei livelli proteici di PS2 grazie a siRNA ha inoltre evidenziato che la PS2 endogena può controllare il grado di interazione tra ER e mitocondri. Questi risultati sono stati infine confermati da esperimenti fatti con sonde “Cameleon” per il Ca2+, basate sul fenomeno del FRET. Complessivamente questi dati forniscono nuovi elementi sull’effetto di PS2 sull’omeostasi del Ca2+ nelle forme familiari della Patologia di Alzheimer e, più in dettaglio, sul ruolo della conformazione di PS2 e sul coinvolgimento di RyR e IP3R nel suo effeto. Un nuovo aspetto del controllo da parte di PS2 sulle dinamiche cellulari (e del Ca2+ in particolare) viene inoltre riportato per la prima volta, cioè che questa proteina può regolare la relazione tra ER e mitocondri, e che mutazioni FAD a suo carico influenzano questa interazione; questo suggerisce ovviamente nuove possibili vie di indagine sull’effetto delle mutazioni a carico delle PS nelle forme familiari di AD.