Cellule staminali tumorali: ruolo della Side Population nei tumori solidi

Many studies performed over the past years have shown that some forms of human cancers are characterized by stem-like-cells (cancer stem cells, CSCs) with specific stem-cell properties. These cells are currently considered as “tumour-initiating“ cells, responsible of tumor relapse. CSCs have the capacity for self-renewal, the potential to develop into any cell and the proliferative ability to drive continued expansion of malignant cells. Many studies have described the rather heterogeneous tumorigenic potential of CSCs and led to the development of the cancer stem cells hypothesis that postulates that only a fraction of cells within a tumour is endowed with stem cells-like features, giving rise to all the other components of the tumour (Jordan CT et al. 2006). Two different approaches to identify CSCs within tumors have been proposed: the first one tracks specific surface markers that are selectively expressed on CSCs but not on the bulk of tumour cells; the second approach exploits some functional characteristics, such as a unique pattern of staining with certain dyes, to identify stem-like cells. In particular this latter method is used for the detection by dual-wavelenght flow cytometry of the so-called side population (SP) on the basis of the ability of these cells to efflux the fluorescent dye Hoechst 33342 (Goodell MA et al 1996). The SP cells represents only a small fraction of the whole cell population and given their ability to efflux drugs, they represent the multi-drug resistant cell fraction within tumors (Hirschmann-Jax C et al. 2004). Moreover, SP cells seem to be an enriched source of stem cells (Challen GA et al. 2006). Solid tumours account for the major cancer burden, and epithelial cancers constitute approximately 80% of all cancers (Visvader J.E. and Lindeman G.J. 2008). The cellular origins of most solid tumours are largely unknown, but it has been speculated that different tumor subtypes reflect distinct cells of origin at the time of tumour initiation. Moreover there is increasing evidence that diverse solid tumours are hierarchically organized and sustained by a distinct subpopulation of CSCs (Visvader J.E. and Lindeman G.J. 2008). A first ongoing study has evaluated the role and the characteristics of cancer stem cells, in particular of the SP cell subset, in Medulloblastoma (MDB) cell lines. MDBs are the most common paediatric solid tumours occurring in the central nervous system (CNS) and recent data have shown that also MDB arises from stem-like cells. We have tried to isolate the subset with stem-like cell properties and to understand which signaling pathway is mainly involved in the CSCs/SP maintenance. First data strongly suggest that MDB cell lines encompass stem-like cells and that the PI3K/AKT/mTOR pathway is crucial for the survival of the SP cells, which have a high capacity to form colonies in vitro. The increased experience in FACS sorter technologies and setting has allowed to well identify SP cells in both primary ovarian cancer cells cultured in vitro and xenografted in nude mice and also to investigate the effects of IFN- on this tumour cell subset. This was the aim of a second study leaded in the Departments of Oncology and Surgical Sciences of Padua in collaboration with our laboratory. Our findings show that IFN- exerts marked antiproliferative and proapoptotic effects on the SP subset, which translates into a therapeutic effect against tumours bearing large amounts of SP cells. These results suggest that screening tumour samples for their SP content could form the basis for rationale-based administration of IFN- to patients with ovarian cancer and possibly other solid tumours. In the last year our research has also focused on the characterization of the CSCs population in brain tumor cell lines and in primary cultures of both Medulloblastoma and Glioblastoma. The tumour microenvironment influences distribution of CSCs within the tumour mass and their resistance to radiation. There are some clues that hypoxia can favour stem cells expansion and maintenance in tumours (Moserle L. et al 2009, Blazek et al 2007, Platet N. et al. 2007). Moreover, preclinical and clinical studies show that local tumour control after radiotherapy inversely correlates with tumour hypoxia (Nordsmark M. et al.2005). Based on these considerations, in the Medulloblastoma (MDB) study we have investigated the link between the hypoxic microenvironment and some molecular pathway (i.e. Notch1 signaling; HIF-1α) that seem to be involved in the maintenance of primary MDB derived cells. First results clearly indicate that MDB derived cells can be successfully expanded in vitro only by preserving them into a hypoxic context. In the Glioblastoma (GMB) study we have exploited image guided surgery to sample multiple intra-tumoral areas to define potential cellular heterogeneity in correlation to the oxygen tension gradient within the GBM mass. Our results indicate that more immature cells, identified with the stem cell marker CD133, are localized in the inner core and in the intermediate layer of the tumour mass, while more committed cells are distributed along the peripheral and neo-vascularised area. These results indicate a correlation between the intra-tumoral hypoxic gradient, the tumour cell phenotype and the tumour resistance to chemotherapy, leading to a novel concentric model of tumour stem cell niche, which may be useful to define the real localization of the chemo-resistant GBM tumour cells in order to design more effective treatment strategies. The last part of this work, different from those discussed above, is focused on the study of the role that IL-23 exert on the B-acute lymphoblastic leukaemia (B-ALL) cells. This study was mainly conducted in the A.I.R.C. Tumor Immunology Unit of the Department of Experimental and Laboratory Medicine, G.Gaslini Institute of Genova. B-cell acute lymphoblastic leukaemia (B-ALL) is a clonal malignant disease originated from a single cell and characterized by the accumulation of blast cells that are phenotypically reminiscent of normal stages of B-cell differentiation (Cobaleda C. and Sánchez-García I. 2009; Onciu M. 2009). Steady progress in development of effective treatments has led to a cure rate of more than 80% in children, creating opportunities for innovative approaches (Pui CH et al. 2006). Studies are underway to ascertain the precise events that take place in the genesis of acute lymphoblastic leukaemia, to enhance the clinical application of known risk factors and anti-leukemic agents, and to identify treatment regimens that reduce relapse. The aim of this study was to investigate the potential direct anti-tumour activity of IL-23 in paediatric B-acute lymphoblastic leukaemia (B-ALL) cells and the molecular mechanisms involved. First results demonstrate that IL-23 possesses anti-leukemic activity on B-ALL cells. We show for the first time that IL-23R is up-regulated in primary B-ALL cells as compared to normal early B lymphocytes, and that IL-23 dampens directly tumour growth in vitro and in vivo through inhibition of tumour cell proliferation and induction of apoptosis. Therefore, in principle, IL-23 may be a good candidate drug to be tested in a phase I trial in childhood B-ALL patients otherwise unresponsive to current therapeutic standards.

CELLULE STAMINALI TUMORALI: RUOLO DELLA SIDE POPULATION NEI TUMORI SOLIDI Molti studi negli ultimi anni hanno dimostrato che alcune forme di tumore sono caratterizzate dalla presenza di cellule con specifiche proprietà stem-like, dette anche cellule staminali tumorali (Cancer Stem Cells/CSCs). Queste cellule sono considerate le cellule “inizianti” il tumore e sono probabilmente le responsabili delle recidive del tumore. Le CSCs hanno la capacità di auto-rinnovarsi, la potenzialità di dare origine a una o più specie cellulari all’interno del tumore e l’abilità di guidare, in modo continuo, la proliferazione delle cellule maligne. Molti studi hanno descritto il potenziale tumorigenico delle CSCs fino ad arrivare alla formulazione della cancer stem cell (CSC) hypothesis, secondo la quale a sostenere la crescita del tumore e a causare recidive, sarebbe una ristretta popolazione cellulare (Jordan CT et al.2006). Sono stati proposti due diversi approcci per caratterizzare le CSCs all’interno del tumore: il primo utilizza marcatori di superficie selettivamente espressi dalle CSCs, ma non dalla maggior parte delle cellule tumorali; il secondo approccio sfrutta alcune caratteristiche funzionali della cellula, come la peculiare capacità di colorarsi con coloranti specifici. In particolare, questo secondo metodo è utilizzato per l'identificazione, tramite citometria a flusso, della cosiddetta Side Population (SP), distinta sulla base della capacità di queste cellule di estrudere il colorante vitale Hoechst 33342 (Goodell MA et al 1996). Le cellule SP rappresentano solo una piccola frazione di tutta la popolazione di cellule e, data la loro capacità di estrudere farmaci, esse rappresentano la frazione chemio-resistente all’interno del tumore (Hirschmann-Jax C et al. 2004). Inoltre le SP sembrano essere una fonte arricchita di cellule staminali (Challen GA et al. 2006). I tumori solidi rappresentano la maggior parte delle patologie maligne ed i tumori epiteliali ne costituiscono circa l'80% (Visvader JE e Lindeman GJ 2008). L’ origine della maggior parte dei tumori solidi è sconosciuta, ma è stato ipotizzato che sottotipi diversi sottendono a cellule inizianti il tumore differenti. Inoltre ci sono evidenze crescenti che diversi tumori solidi siano organizzati in modo gerarchico e sostenuti da una sottopopolazione distinta di CSCs (Visvader JE e Lindeman GJ 2008). Un primo studio ancora in corso ha valutato il ruolo e le caratteristiche delle cellule staminali tumorali, in particolare della sottopopolazione SP, in linee cellulari di Medulloblastoma (MDB). Il MDB è uno dei più comuni tumori solidi pediatrici a livello del sistema nervoso centrale e dati recenti hanno dimostrato che anche il MDB sembra originare da una componente staminale. Abbiamo cercato di isolare la sottopopolazione con caratteristiche stem-like per capire quale pathway fosse principalmente coinvolto nel mantenimento della componente staminale (CSCs/SP). I primi dati ottenuti suggeriscono che nelle linee di MDB è presente una componente staminale e che la via di PI3K/AKT/mTOR è cruciale per la sopravvivenza delle cellule SP, che hanno una elevata capacità di formare colonie in vitro. Una sempre maggiore esperienza nella tecnologia e nel setting del FACS (Flow Activated Cell Sorter) sorter ha permesso di estendere l’approccio sperimentale ad altri tipi di tumore e quindi di identificare le SP sia in cellule primarie di carcinoma ovarico che in cellule, sempre di carcinoma ovarico, xenotrapiantate in topi NOD/SCID e di indagare gli effetti che l’ IFN-? ha sulle cellule tumorali. Questo è stato l'obiettivo di un secondo studio condotto nel Dipartimento di Oncologia e Scienze Chirurgiche di Padova in collaborazione con il nostro laboratorio. I nostri risultati mostrano che IFN-? ha effetti antiproliferativi e proapoptotici sulla componente SP, che si traducono in un potenziale effetto terapeutico contro quei tumori caratterizzati da una elevata percentuale di cellule SP. Questi risultati suggeriscono che lo screening dei campioni di tessuto tumorale per il loro contenuto di SP potrebbe costituire la base per la somministrazione di IFN-? ai pazienti con tumore ovarico ed eventualmente con altri tumori solidi. Nel corso dell’ultimo anno la nostra ricerca si è concentrata anche sulla caratterizzazione delle CSCs in linee cellulari e in colture primarie sia di medulloblastoma (MDB) che di glioblastoma (GBM). E’ noto che il microambiente o nicchia del tumore influenza la distribuzione della CSCs all'interno della massa tumorale e la loro resistenza alle radiazioni. Ci sono alcune evidenze che l'ipossia può favorire l'espansione delle cellule staminali e il mantenimento del tumore (Moserle L. et al 2009, Blazek et al 2007, Platet N. et al. 2007). Inoltre, studi preclinici e clinici indicano che c’è una relazione inversa tra andamento del tumore e ipossia (Nordsmark M. et al.2005). Sulla base di queste considerazioni, nello studio sul medulloblastoma (MDB) abbiamo indagato il legame tra il microambiente ipossico e alcune vie del segnale (Notch1; HIF-1a) che sembrano essere coinvolte nel sostenere la crescita delle cellule di MDB. I primi risultati indicano chiaramente che le cellule di MDB possono essere espanse con successo in vitro solo in un contesto di ipossia. Nello studio sul Glioblastoma (GMB), abbiamo sfruttato la chirurgia immagine-guidata per cercare di definire differenti aree intra-tumorali per capire se ci fosse una distribuzione eterogenea delle cellule correlata al gradiente di ossigeno all'interno del GBM. I nostri risultati mostrano che le cellule più immature, identificate con il marcatore di staminalità CD133, sono localizzate nella parte interna e in quella intermedia della massa tumorale, mentre le cellule più differenziate sono distribuite lungo la zona periferica e maggiormente vascolarizzata. Questi risultati indicano una stretta correlazione tra il gradiente di ipossia intra-tumorale, il fenotipo delle cellule tumorali e la resistenza del tumore alla chemioterapia, portando alla formulazione di un nuovo modello di distribuzione delle cellule staminali nella nicchia del tumore, che potrebbe essere utili per definire con più precisione la reale localizzazione della cellule tumorali chemio-resistenti nel GBM, al fine di elaborare strategie di trattamento più efficaci. L'ultima parte di questa tesi, che esula dagli argomenti trattati sopra, si è focalizzata sullo studio del ruolo che la IL-23 esercita sulle cellule di leucemia linfoblastica acuta-B (B-ALL). Questo studio è stato condotto principalmente nella Unità di Immunologia del Dipartimento di Medicina Sperimentale e Laboratorio dell’ Istituto G.Gaslini di Genova. La Leucemia linboblastica acuta (LLA) è una patologia in cui il blocco della differenziazione, l’iperprpolifrazione e una apoptosi difettosa risultano in un accumulo aberrante di un clone cellulare. Le B-ALL rappresentano l’85% dei casi delle leucemie infantili e vengono distinte in diversi sottotipi a seconda dello stadio maturativo della cellula linfoide (Cobaleda C. e García Sánchez-I . 2009, Onciu M. 2009). Nonostante i progressi degli ultimi anni nello sviluppo di trattamenti sempre più efficaci sono comunque in corso ulteriori studi per capire quali siano gli eventi specifici che portano alla leucemia, per migliorare l'approccio clinico e identificare terapie che possano ridurre le recidive della malattia. L'obiettivo di questo lavoro è stato quello di studiare l’espressione e la funzione del recettore della IL-23 (IL23R) nelle cellule di leucemie acuta B pediatrica (B-ALL) rispetto alla controparte normale e verificare se la IL-23 potesse esercitare una azione anti tumorale diretta sulle cellule di leucemia B e se sì quale fosse il meccanismo coinvolto. I primi risultati ottenuti dimostrano che IL-23R è up-regolato nelle cellule primarie di B ALL rispetto alla controparte normale e che la IL-23 media direttamente la crescita tumorale in vitro e in vivo attraverso l'inibizione della proliferazione delle cellule tumorali e l’ induzione della apoptosi. Pertanto, in linea di principio, la IL-23 potrebbe essere un buon farmaco da testare in trial di fase I in pazienti pediatrici affetti da B-ALL che non rispondono alle attuali terapie.