EFFETTI CELLULA-SPECIFICI E COMPENSAZIONE FUNZIONALE DI EMILINA-1 E MULTIMERINA-2 NEL SISTEMA CARDIOVASCOLARE

Emilin/Multimerin family consists of extracellular matrix glycoproteins with a common multimodular structural organization. In mammals four proteins belong to this family and two of these are Emilin-1 and Multimerin-2. They have a particularly domain called EMI with TGF-β inhibitory activity. These proteins share structural organization and partially cardiovascular expression. Emilin1-/- e Mmrn2-/- mice show a cardiovascular phenotype characterized by reduction of arterial calibre and systemic arterial hypertension caused by increase of peripheral vascular resistances. This phenotype is linked to the inhibitory role of Emilin-1 and Multimerin-2 in TGF-β1 processing. Moreover, vessels of Emilin1-/- mice have ultrastructural alterations, represented by defective anchorage of endothelial cells to inner elastic lamina and notable increase of smooth muscle cells with abnormal morphology (cells are detached from elastic lamellae and exhibit enlarged organelles and sometimes condensed chromatin). Although these proteins share similarities in structural organization and cardiovascular distribution and, in vitro, they have the same biochemical activity in the regulation of TGF-β1 processing, the existence of a knockout phenotype indicates that the two proteins cannot compensate for each other. Causes for lack of functional compensation could be various. One is the different localization of Emilin-1 and Multimerin-2 in arterial vessels. Here Multimerin-2 is expressed only in the endothelium whereas Emilin-1 is secreted by endothelial cells, smooth muscle cells and adventitia fibroblasts. To understand endothelial and muscular contribution in the cardiovascular phenotype of Emilin-1 knockout mice, we have studied phenotype rescue by expressing transgenes that drive expression of Emilin-1 cDNA only in endothelial or smooth muscle cells. We have found that Emilin-1 expression by vascular smooth muscle cells recovers hypertension, hypotrophic remodelling and ultrastructural changes of tunica media, but it does not improve endothelial ultrastructural alterations. Instead, protein expression by endothelium rescues normal anchorage of endothelial cells to inner elastic lamina, but it does not recover hypertension and smooth muscle cell damages. Our results suggest that Emilin-1 expression is required in vascular smooth muscle cells to maintain normal blood pressure and tunica media structure of arterial vessels, while the function of the protein produced by endothelial cells is presently unknown. To analyse reasons of physiological lack of functional compensation between Emilin-1 and Multimerin-2, we have chosen to study especially endothelial cells, because they produce both 10 proteins. In this region, Multimerin-2 deficiency is not compensated by Emilin-1 physiological synthesis or overexpression. In fact, overexpression of Emilin-1 cDNA in the endothelium does not restore normal blood pressure in Mmrn2-/- mice. These results suggest the existence of functional differences between Emilin-1 and Multimerin-2 linked to structural regions different from EMI domain, the region responsible for the TGF-β inhibitory activity. Probably, Emilin-1 and Multimerin-2 sequential and/or structural diversities differentially regulate their processing or interactions with other molecules or the multimeric aggregation within the extracellular matrix.

La famiglia delle Emiline/Multimerine è costituita da glicoproteine della matrice extracellulare caratterizzate da una comune organizzazione strutturale multimodulare con la presenza di un dominio detto EMI, che ha la proprietà di inibire l’attività del fattore di crescita TGF-β. Nei mammiferi essa comprende 4 membri, tra cui Emilina-1 e Multimerina-2, che, oltre all’organizzazione strutturale, condividono l’espressione nel sistema cardiovascolare, benché parzialmente sovrapponibile. Topi Emilin1-/- e Mmrn2-/- manifestano la presenza di un fenotipo cardiovascolare, caratterizzato da ipertensione arteriosa sistemica associata ad aumento delle resistenze vascolari periferiche e da riduzione del lume delle arterie. In entrambi i casi, il fenotipo è legato al ruolo delle due proteine come inibitori del TGF-β1. Inoltre, in topi Emilin1-/- i vasi mostrano alterazioni ultrastrutturali, rappresentate da frequenti zone di distacco delle cellule endoteliali dalla lamina elastica interna e da un notevole aumento di cellule muscolari lisce dalla morfologia alterata (cellule poco aderenti alle lamine elastiche con organelli membranosi espansi e talora condensazioni nucleari). Nonostante queste proteine presentino omologie nell’organizzazione strutturale, parziali sovrapposizioni della distribuzione nel sistema cardiovascolare e una identica attività biochimica in vitro nella regolazione del TGF-β1, lo sviluppo di fenotipi simili in seguito ad inattivazione genica indica l’esistenza di sostanziali differenze tra le due molecole per cui una non è in grado di rimpiazzare la mancanza dell’altra. Le cause della mancata fisiologica compensazione funzionale possono essere molteplici. Una consiste nella differenza di distribuzione di Emilina-1 e Multimerina-2 nei vasi, nei quali Multimerina-2 è espressa solo dall’endotelio, mentre Emilina-1 è prodotta dalle cellule endoteliali, dalle cellule muscolari lisce della media e dai fibroblasti dell’avventizia. Per comprendere quale contributo danno cellule endoteliali e cellule muscolari lisce vascolari nell’insorgenza del fenotipo cardiovascolare dei topi mutanti per Emilina-1 è stato studiato il recupero del fenotipo dei topi Emilin1-/- grazie all’espressione di costrutti transgenici in cui la trascrizione del cDNA di Emilina-1 è guidata da promotori specifici per cellule endoteliali o per cellule muscolari lisce. I risultati mostrano che l’espressione di Emilina-1 nelle cellule muscolari lisce è in grado di correggere l’ipertensione, il rimodellamento ipotrofico e le alterazioni ultrastrutturali della tonaca media, mentre non ha effetto sulle alterazioni ultrastrutturali delle cellule endoteliali. Al contrario, l’espressione della proteina nell’endotelio ripristina la normale adesione delle cellule endoteliali alla lamina elastica interna, ma lascia inalterata l’ipertensione e i danni della tonaca media dei vasi arteriosi. Questi risultati suggeriscono che un corretto controllo della pressione sanguigna e della struttura della media richiedono l’espressione di Emilina-1 da parte delle cellule muscolari lisce, mentre la produzione della proteina da parte delle cellule endoteliali ha una funzione al momento sconosciuta. Le indagini rivolte alla comprensione dell’assenza di fisiologica compensazione funzionale tra Emilina-1 e Multimerina-1 riguardano le cellule endoteliali, unico tipo di cellule da cui sono prodotte entrambe le proteine. In questo distretto, nè la sintesi fisiologica di Emilina-1 né la sua sovraespressione sono sufficienti per sostiture le funzioni di Multimerina-2 quando assente. Infatti, in esperimenti finalizzati allo studio del recupero del fenotipo dei topi Mmrn2-/- mediante espressione di un transgene che sovraesprime il cDNA di Emilina-1, non abbiamo osservato ripristino dei normali valori di pressione arteriosa, concludendo che la mancanza di compensazione non è dovuta ad insufficiente produzione di Emilina-1 dall’endotelio. Questi risultati portano a ipotizzare l’esistenza di differenze funzionali tra Emilina-1 e Multimerina-2 legate a regioni strutturali diverse dal dominio EMI, che per le due proteine ha in vitro la stessa funzione. È possibile che differenze di sequenza e/o struttura ne regolino diversamente i processi di biosintesi o le proprietà di interazione con altre molecole o i processi di aggregazione sovramolecolare rendendo Emilina-1 e Multimerina-2 geneticamente non ridondanti.