Synthesis, characterization and anticancer activity of Gold(III) complexes with peptido ligands

The selective delivery of pharmacologically active compounds into the tumor cell represents a major issue in cancer research. The therapeutic use of cisplatin is associated with some serious clinical problems, such as severe normal tissue toxicity and resistance to the treatment. To overcome these problems, the anticancer activity of Au(III)-dithiocarbamato derivatives has been recently investigated.. Those complexes turned out to be extremely promising in terms of greater in vitro and in vivo antitumor activity, lack of cross-resistance, and reduced toxic and nephrotoxic side-effects compared to cisplatin, accounting for a different mechanism of action. In fact, further biological studies identified proteasome as a major target and showed that the inhibition of the proteasomal activity is associated with both apoptotic and non-apoptotic pathways. On the other hand, two plasma membrane proteins, PEPT1 and PEPT2, have been recently identified. They are present predominantly in epithelial cells of the small intestine, mammary gland, lung, choroid plexus, kidney and in other cell types. These proteins are able to transport across membranes all possible di- and tripeptides containing L-amino acid residues. To obtain compounds with superior chemotherapeutic index in terms of increased bioavailability, higher cytotoxicity, and lower side-effects than cisplatin, we extended our research to Au(III)-dithiocarbamato complexes functionalized with peptides, to exploit peptide transporters PEPT1 and PEPT2. These complexes should be able to maintain the properties of the previously reported gold(III) analogues together with an enhanced bioavailability through the peptide-mediated cellular internalization. We report in this work on a series of Au(III)-dithiocarbamato complexes, covalently bound to oligopeptides (from di- to penta-), of different amino acids sequences (chiral and achiral, hydrophobic and hydrophilic, aliphatic and aromatic), bearing different C-terminal protecting/blocking groups. All the peptides have been synthesized, purified and characterized by mass spectrometry, mono or/and bidimensional NMR and FT-IR spectroscopy. In addition the conformation of rigid peptides (based on the 310 helix promoting Cα-tetrasubstituted residue Aib) have been studied. The corresponding Au(III)dithiocarbamato derivatives were synthesized, purified and characterised by elemental analysis, mono or/and bidimensional NMR and FT-IR spectroscopyand thermogravimetric analysis. Moreover, the conformation of two chiral compexes was investigated. In order to clarify their interaction with biological active molecules, in particular the glutathione, the study of the reaction between the gold(III)-dibromo(sarcosylglycyltertbutylester) dithiocarbamato complex with L-NAC has been performed. Some of the complexes have been tested for their in vitro cytotoxic activity. Among all, the Gly- and Aib-tertbutyl-ester-containing-dipeptides Au(III) derivatives, have notably shown, to a high degree, to be more cytotoxic than cisplatin and the previously synthesized Au(III) analogues. Preliminary in vivo antitumour activity studies have also been performed, showing prominent results in term of higher in vivo effectiveness compared to the previously synthesized Au(III) analogues.

Una delle sfide maggiori a cui deve dare risposta l’attuale ricerca sul cancro è quella di riuscire a indirizzare i farmaci in modo selettivo verso la cellula tumorale. Tra i chemioterapici maggiormente utilizzati in terapia ci sono i composti a base di platino, tra cui il cisplatino, ma la loro notevole attività antitumorale è accompagnata da una elevata tossicità Infatti presentano numerosi inconvenienti che ne precludono l'utilizzo per lunghi periodi di tempo: sono altamente neuro- e nefrotossici, inducono pesanti effetti collaterali (alopecia, diminuzione dell’udito, ecc) ed in molti casi, dopo un iniziale successo terapeutico, causano l'insorgenza di resistenza da parte delle cellule cancerose. Per superare tali limiti, è stata recentemente studiata l’attività antitumorale di derivati ditiocarbammici di Au(III). Questi composti hanno dimostrato di avere un’attività più elevata delcisplatino, sia in vitro che in vivo, e una tossicità sistemica inferiore. Inoltre, poichè non presentano resistenza crociata col chemioterapico di riferimento, agiscono probabilmente secondo un meccanismo diverso. Infatti, vari studi hanno evidenziato che il proteasoma è uno dei bersagli dei complessi di Au(III) e che l’inibizione dell’attività proteasomica è associata ai meccanismi apoptotici e non apoptotici. In letteratura è stato recentemente riportato che due proteine di membrane, PEPT1 e PEPT2, localizzate principalmente nelle cellule epiteliali dell’intestino, delle ghiandole mammarie, del plesso coroideo polmonare e dei reni, sono in grado di trasportare attraverso la membrana cellulare tutti i di- e tripeptidi costituiti da L-amminoacidi. Abbiamo pertanto sintetizzato complessi ditiocarbammici di Au(III) funzionalizzati con leganti peptidici, che, grazie ai sistemi cooperativi con le proteine di trasporto, potrebbero avere un indice terapeutico superiore ai composti di platino in termini di migliore biodisponibilità, maggiore citossicità e minori effetti collaterali. In questo lavoro di tesi, si riportano la sintesi, la purificazione e la caratterizzazione di una serie di complessi ditiocarbammici di Au(III), covalentemente legati ad oligopeptidi (dal di- al penta), con sequenze amminoacidiche diverse (achirali e chirali, idrofobiche e idrofiliche, alifatiche e aromatiche), recanti diversi tipi di gruppi protettori/bloccanti C-terminali. I peptidi sono stati sintetizzati, purificati e caratterizzati tramite spettrometria di massa, spettroscopia NMR mono e bidimensionale e FT-IR. Inoltre, studi conformazionali sono stati effettuati su peptidi rigidi (contenenti l’aminoacido Cα-tetrasostituito Aib, che favorisce l’assunzione di strutture elicoidali 310) I corrispondenti complessi ditiocarbammici di Au(III) sono stati sintetizzati, purificati e caratterizzati tramite analisi elementari, spettroscopie FT-IR e NMR mono e bidimensionale, termogravimetria. Oltre a ciò, è stato eseguito uno studio conformazionale di due complessi con peptidi chirali. Per chiarire i meccanismi d’interazione con le molecole di interesse biologico come il glutathione, è stata inoltre studiata la reazione fra L-NAC e il complesso di bromo(sarcosilgliciltertbutil-estere)dithiocarbamato di Au(III). Sono stati eseguiti studi preliminari in vitro di citotossicità su alcuni complessi presi come riferimento. Fra questi, i derivati Au(III) dei dipeptidi contenti Gly- e Aib-OtBu hanno dimostrato di avere una citotossicità molto maggiore rispetto a quella del cisplatino. Dati molto incoraggianti sono stati, infine, messi in evidenza dai test in vivo, eseguiti recentemente su un tumore xenografico della mammella.