Mesenchymal stem cells and their extracellular vesicles in the control of pathological angiogenesis

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a heterogeneous population of adherent cells with self-renewable capacity and with a wide distribution in adult organisms; they can be isolated from adult tissues including bone marrow, adipose tissue, kidney and liver (Crisan et al., 2008). As multipotent progenitor cells, MSCs are able to differentiate into various cell types, especially of the mesodermal lineage, thus representing an important opportunity for regenerative medicine (Caplan, 1991). Besides this application, MSCs are able to control cell survival, organ function and inflammation. Remarkably, conditioned medium collected from MSCs can exert many of these paracrine effects, suggesting that the major mechanism of action of MSCs relies on soluble factors rather than cell–cell contact (Madrigal et al. 2014, Zanotti et al. 2013). A well-established feature of MSCs is their ability to inhibit inflammation and immunity, both in vitro and in vivo. Several studies have demonstrated that MSCs may be a useful therapeutic option for the treatment of immune-mediated disorders such as type 1 diabetes (T1D), rheumatoid arthritis (RA) and graft-versus-host disease (GVHD), but also transplantation rejection and neurodegenerative diseases (Ram Sharma et al. 2014, Ying Wang et al. 2014, Klinker et al. 2015) In order to better characterize the paracrine mechanism responsible for MSCs immunomodulatory properties, we performed a shotgun proteomic analysis of the mouse MSCs-conditioned medium, in collaboration with Prof. Gabriella Tedeschi from the University of Milan. Since the MSCs anti-inflammatory phenotype is induced by a pro-inflammatory environment (Bernardo ME et al. 2013, Groh ME et a. 2005), we stimulated MSCs with a cocktail of cytokines (IL1beta, IL6 and TNFalpha) in order to compare the medium conditioned by activated MSCs (st MSC-CM), with that derived from unstimulated MSCs. Interestingly, we found that the stimulation with pro-inflammatory cytokines (IL1beta, IL6 and TNFalpha) induces a remarkable change in the whole secretome; notably, most of proteins secreted by stimulated MSCs are involved in the regulation of angiogenesis. Among the factors up-regulated by conditioned MSCs, we identified the tissue inhibitor of metalloproteinases 1 (TIMP-1), a specific glycoprotein implicated in the endogenous inhibition of metalloproteinases (Lambert et al. 2004). We demonstrated that MSCs affect local inflammation trough the release of TIMP-1, both in in vitro and in vivo experimental settings. Specifically, by the secretion of TIMP-1, MSCs block the formation of new vessels at the draining lymph node of immunized mice. This event results in a decreased recruitment of leukocytes from the blood flow into the inflamed tissue, leading to a local suppression of the immune response (Zanotti and Angioni, Leukemia 2016). In order to design successful pre-clinical experiments as well as clinical trials, the analysis of human MSCs secretome was required. Thus, in collaboration with Prof. Gabriella Tedeschi, we performed a mass spectrometry based proteomic approach to analyse how pro-inflammatory cytokines modulate the composition of the human MSCs (hMSCs) secretome. Comparative analysis of hMSC-CM and mMSC-CM confirmed that the exposure to pro-inflammatory cytokines results in increased secretion of a number of immunomodulatory and angiogenesis-related proteins by MSCs from both species. Notably, 62% of the proteins identified in st hMSC-CM were also identified in st mMSC-CM, clearly highlighting the existence of a common signature in the secretome of human and mouse MSCs. However, despite the similar proteomic signature in response to stimulation by pro-inflammatory cytokines of human and mouse MSCs, our data indicate that they may induce different biological responses. For example, although the growth factor M-CSF/CSF1 is up-regulated in both human and mouse MSC-CM upon stimulation, only hMSC-CM efficiently induce macrophage differentiation; this is probably due to the different concentration of secreted M-CSF, which is higher in human-derived supernatants. Concerning angiogenesis, our data fully corroborate the anti-angiogenic role of stimulated MSCs for both mouse and human samples. In particular, we confirmed the key role of TIMP-1 as anti-angiogenic factor, both in human and mouse cells (Maffioli E et. al 2017). Complete mass spectrometry data are available via ProteomeXchange with identifier PXD005746. Although worldwide there are about 600 registered clinical trials evaluating the potential of MSCs-based cell therapy (see www.clinicaltrials.gov), this approach still remains far from a fully developed and safe clinical technology. Importantly, a standardized and unifying protocol addressing which source of MSCs should be used and which is the best route of administration is still missing. Moreover, even the parameters of quality and safety of MSCs are not universally established. To overcome all these issues, we focused our attention on an alternative approach, exploiting products derived from MSCs rather than MSCs themselves, which may represent a cost-effective and safer approach. One of the best-characterized MSCs product are MSCs-derived extracellular vesicles (EVs) (Biancone L et al., 2012). EVs arise from the plasma membrane and are released by cells as particles. In accordance with the recommendations of the International Society for Extracellular Vesicles (ISEV), EVs can be classified according on their size, origin, and isolation methods, into three main classes: (i) Microvesicles or shedding vesicles (size between 50 and 1000 nm, budding from the plasma membrane, and enriched in CD40); (ii) Apoptotic bodies (size between 800 and 5000 nm, derived from fragments of dying cells, and enriched in histones and DNA); and (iii) Exosomes, which are small (~30–120 nm) membrane vesicles of endocytic origin (enriched in late endosomal membrane markers, including Tsg101, CD63, CD9, and CD81) (Yáñez-Mó, 2015). Several studies have reported that MSCs-derived EVs display therapeutic potential in a similar fashion to their parent cells (Merin-Gonzàles et al. 2016). For example, it has been shown that MSCs-derived EVs reduce infarct size and enhance tissue repair in cardiovascular disease (Lai et al. 2010). More in general, it seems that EVs derived from unstimulated MSCs may reduce fibrosis and apoptosis, but sustain stem cell differentiation. Thus, MSCs-derived EVs are able to reinforce the regeneration process associated to not only cardiovascular disease but also liver, lung and acute kidney injury (Sweta Rani et al. 2015). To investigate MSCs-derived EV effect on angiogenesis, we first isolated and concentrated vesicles from the conditioned medium of MSCs stimulated with pro-inflammatory cytokines. We analysed the effect of EVs in vitro by endothelial cell tube formation assay, using EVs released by unstimulated MSCs as control. Our data confirmed that vesicles derived from stimulated MSCs affect the tubulogenesis process, perfectly mimicking the anti-angiogenic effect of the whole conditioned medium. Remarkably, the neutralization of TIMP-1 by a blocking antibody was able to revert this effect. Accordingly, through western blot analysis, we found that TIMP-1 is present in EVs derived from stimulated MSCs only. In the tubulogenesis assay, the degradation of the matrigel, with which plates are coated, is an essential step for the formation of an elongated and well-organized tube network. TIMP-1, secreted by st MSCs trough the release of EVs, plays a crucial role in the inhibition of this process, likely by inhibiting the matrix metalloproteinase activity required for the efficient matrigel digestion. However, endothelial cell migration represents another fundamental step during angiogenesis. In order to investigate this aspect of the angiogenic process, we set up a different assay based on the ability of cells to move in a free space: the wound healing scratch assay (Liang CC et al. 2007). Wound was made by scratching a line across the bottom of the dish on a confluent endothelial monolayer. After that, cells were treated with EVs from MSC-CM plus VEGF, with or without TIMP-1 blocking antibody. As expected, the pro angiogenic signal VEGF increases the migration of endothelial cells and st- MSCs-derived EVs block this process. However, in this condition, the TIMP-1 blocking treatment didn’t rescue the process. This suggests that st- MSCs-derived EVs are able to block angiogenesis through a second mechanism. Endothelial cell motility depends on the rapid reorganization of the actin network that, in turn, modulates not only the cell shape but also cell migration. In this context, reactive oxygen species (ROS) have emerged as crucial regulators. However, their effect, supporting or inhibiting angiogenesis, remains still controversial, and seems to depend on their localization and, in particular, on their concentration (Marcelo L. Lamers et al. 2011, Carlos Wilson et al. 2015). Indeed, low oxidant concentration regulates VEGF receptor cross-phosphorylation and redox-dependent downstream signalling (Lamalice et al. 2007). In contrast, high levels of oxidative species cause endothelial cell dysfunction due to an alteration in migration, increased apoptosis and an induction of senescence (Lum et al. 2001, Rong Liu et al. 2014). To investigate the role of ROS on the inhibition of endothelial cell migration induced by st MSCs-derived EVs, we analysed the production of oxidative species in migrating endothelial cells treated with unst- or st- MSCs-derived EVs. Interestingly, st MSCs-derived EVs were able to increase ROS production in the endothelial cells at the front of migration, thus suggesting that an oxidative unbalance could participate to the anti-angiogenic effect induced by st- MSCs-derived EVs. Nox2 represents the main key regulator of ROS production in endothelial cells, and adenosine has been implicated in its control (Sapna Thakur et al. 2010). Adenosine is catabolized from ATP (adenosine-5'-triphosphate) by the enzymes CD39 (nucleoside triphosphate dephosphorylase) and CD73 (ecto-5'-nucleotidase). Previous studies have demonstrated that exosomes may express this couple of adenosine-generating enzymes (Clayton A et al. 2011, Schuler PJ et al. 2014, Amarnath S et al. 2015). By western blot analysis, we demonstrated CD39 and CD73 expression in st- MSCs-derived EVs. Moreover, when performing the scratch assay in presence of an ecto-ATPase inhibitor ARL 67156 and AMP-CP, which inhibit respectively CD39 and CD73, we were able to rescue the migrating block caused by st MSC-derived EV treatment, and preliminary data suggest that the CD39 inhibition leads to a decrease in the ROS accumulation. This supports our hypothesis that st- MSCs-derived EVs, carrying CD39 and CD73, are able to increase the concentration of the extracellular adenosine, which binds adenosine receptors expressed on the surface of endothelial cells, leading to the activation of Nox2 and, in turn, to the production of ROS. Furthermore, the inhibition of ROS accumulation obtained using a generic antioxidant (NAC), fully rescued endothelial cell migration. We are planning to perform further experiments to identify the specific adenosine receptor involved in this process and its connection with Nox2. To validate our results in vivo, we analysed the anti-angiogenic effect of st- MSCs-derived EVs in the retinal vascularization mouse model, a very useful tool in the study of physiologic vessel sprouting (Andreas Stahl et al. 2010). Indeed, in contrast to humans, mouse pups have an immature retinal vasculature at the birth; the development completes in some weeks. The retinal vascularization proceeds in a tightly regulated and organized manner, reliable for detection of any defect (Stahl et al. 2010). Thus, C57BL/6J pups were intra-peritoneally injected with unstimulated or stimulated MSCs-derived EVs, and sacrificed 5 days later to collect retinas. Samples were dissected and stained to measure the vasculature formation of developing retina by confocal microscopy. Remarkably, we observed a decrease in the retina vascular arborisation of pups treated with st- MSCs-derived EVs, but no effect with the unstimulated counterpart. We also took advantage of another mouse model, the matrigel plug assay, which consists in the analysis of the vascularization of a matrigel plug that was previously supplemented with EVs and then implanted in the dorsal back of C57BL/6-N mouse. Both models confirm that st MSC derived-EVs show anti-angiogenic proprieties. Further experiments will be performed to measure the ROS concentration in retinas treated with st- MSCs derived-EVs. Moreover, we will use in vivo st- MSCs-derived EVs knock-down for TIMP-1 (that we already obtained by siRNA approach) with or without CD39 inhibitor to rescue the phenotype. To conclude, our data indicate that MSCs specifically target endothelial cells to control angiogenesis through the release of extracellular vesicles. In particular, when exposed to pro-inflammatory cytokines, MSCs release EVs that strongly inhibit the angiogenic process. This inhibition is mediated by at least two co-operating mechanisms targeting two aspects of the angiogenic process. Thus, on the one hand, EVs-delivered TIMP-1, by inhibiting MMPs, affects the ability of endothelial cells to degrade the surrounding extracellular matrix. On the other, the local production of adenosine, due to the presence of CD39/CD73 enzymes on EVs released by st- MSCs, induces Nox2 activation and ROS production in endothelial cells, thus affecting endothelial cell motility and proliferation. We believe that these findings are of utmost importance to understand the biological role of MSCs and to exploit them in therapy. Indeed, our data confirm the emerging concept of MScs as sensors of the microenvironment to control physiological and pathological events. Thus, while in hypoxic condition MSCs release vesicles enhancing the angiogenic process (Consuelo Merino-González et al. 2016, Gangadaran P. et al. 2017, Jiejie Liuet al. 2015,Suyan Bian et al. 2014), within the inflammatory milieu MScs acquire an anti-inflammatory phenotype by inhibiting both the immune cells’ activity (Soraia C. Abreu et al. 2016, Claudia Lo Sicco et al. 2017) and the immune-associated angiogenesis (Angioni et al., manuscript in preparation; Maffioli E. et al.2017; Zanotti, Angioni et al. Leukemia 2016). This evidence provides new perspectives to exploit MSCs in therapy. EVs derived from st-MSCs may represent a very effective approach for the treatment of pathological angiogenesis for several reasons: they seem to target specifically the endothelium, inhibit the angiogenesis acting on multiple pathways, and are more standardisable than MSCs.

Le cellule staminali mesenchimali (MSCs) sono una popolazione eterogenea di cellule, aderenti alla plastica, con capacità di auto-rinnovamento. Esse hanno un'ampia distribuzione negli organismi adulti, infatti, possono essere isolate da diversi compartimenti tissutali tra cui il midollo osseo, il tessuto adiposo, il rene e il fegato (Crisan et al., 2008). In quanto cellule progenitrici multipotenti, le MSCs sono in grado di differenziarsi in vari tipi di cellule, in particolare quelle appartenenti alla linea mesodermica, rappresentando così un'importante opportunità per la medicina rigenerativa (Caplan, 1991). Oltre a questa proprietà, le MSCs sono in grado di controllare la sopravvivenza cellulare, la funzionalità dell'organo e l'infiammazione. Il terreno condizionato da MSCs, inoltre, può esercitare molti di questi effetti, suggerendo che il principale meccanismo d'azione delle MSCs è mediato da fattori solubili, piuttosto che dal contatto diretto con altre cellule (Madrigal et al., 2014, Zanotti et al. 2013). Una caratteristica ben descritta di queste cellule è la loro capacità di inibire l'infiammazione, sia in vitro che in vivo. Diversi studi, infatti, hanno dimostrato che le MSCs controllano negativamente la risposta immunitaria associata a diverse patologie, come il diabete di tipo 1 (T1D), l'artrite reumatoide (RA) e la graft-versus-host disease (GVHD), ma anche il rigetto del trapianto e le malattie neurodegenerative, rappresentando cosi un interessante approccio terapeutico (Ram Sharma et al., 2014, Ying Wang et al., 2014, Klinker et al., 2015) Per meglio caratterizzare il meccanismo paracrino responsabile delle proprietà immunomodulatorie delle MSCs, in collaborazione con la professoressa Gabriella Tedeschi dell'Università di Milano, abbiamo eseguito un'analisi proteomica del terreno condizionato da tali cellule. Dal momento che il fenotipo immunosoppressorio delle MSCs è indotto da un ambiente pro-infiammatorio (Bernardo ME et al., 2013, Groh ME et al., 2005), abbiamo stimolato le cellule con un insieme di citochine (IL1, IL6 e TNF). Tramite il confronto del secretoma delle MSCs stimolate (st MSC-CM), note per le loro proprietà immuno-modulanti, con quello delle MSCs non stimolate (unst MSC-CM), prive di effetti immunosoppressori, abbiamo identificato potenziali fattori responsabili dell’effetto terapeutico delle st- MSCs. Innanzitutto, i dati ottenuti evidenziano che la stimolazione con citochine pro-infiammatorie (IL1, IL6 e TNF) induce un notevole cambiamento nell'intero secreto delle MSCs. In particolare, la maggior parte delle proteine rilasciate esclusivamente dalle MSCs attivate con citochine pro-infiammatorie risultano essere coinvolte nella regolazione dell'angiogenesi. Tra questi fattori abbiamo identificato l'inibitore tissutale delle metalloproteinasi 1 (TIMP-1), una specifica glicoproteina implicata nella soppressione endogena delle metalloproteinasi (Lambert et al., 2004). Abbiamo quindi dimostrato, sia in vitro che in vivo, che le MSCs attivate da citochine pro-infiammatorie influenzano l'infiammazione locale attraverso il rilascio di questa proteina. Mediante la secrezione di TIMP-1, infatti, le MSCs bloccano la formazione di nuovi vasi sanguigni nel linfonodo drenante, essenziali per il reclutamento di leucociti circolanti al tessuto infiammato. Questo evento è, di conseguenza, responsabile della soppressione locale della risposta immunitaria (Zanotti and Angioni et al., 2016). Tutti questi dati sono stati, però, collezionati dallo studio di MSCs murine in un modello di infiammazione in topo. Con il fine ultimo di sviluppare un approccio clinico, abbiamo deciso di analizzare il secreto delle MSCs umane (hMSCs). Pertanto, in collaborazione con la professoressa Gabriella Tedeschi, mediante spettrometria di massa abbiamo esaminato come le citochine pro-infiammatorie modulano anche la composizione del secretoma umano. L'analisi comparativa del secretoma delle MSCs umane e murine, stimolate e non, ha confermato che l'esposizione a fattori pro-infiammatori determina, in entrambe le specie, un incremento nel rilascio di proteine legate all'immuno-modulazione e all'angiogenesi. In particolare, il 62% delle proteine nel secretoma umano, rilasciate in risposta a citochine pro-infiammatorie, è stato identificato nel suo corrispondente murino. Tale evidenza ha quindi dimostrato chiaramente l'esistenza di una somiglianza di tali specie cellulari nella risposta all’infiammazione. Tuttavia, nonostante l’analoga risposta alla stimolazione, i nostri dati indicano che i fattori solubili rilasciati da MSCs murine e umane possono indurre diverse risposte biologiche. Ad esempio, sebbene la secrezione del fattore di crescita M-CSF / CSF-1 sia indotta dopo stimolazione in entrambe le specie cellulari, solo nelle cellule umane questa induce efficacemente la differenziazione dei macrofagi; probabilmente per una diversa concentrazione di M-CSF secreto, maggiore nei surnatanti derivati dall'uomo. Per quanto riguarda l'angiogenesi, i nostri dati corroborano pienamente il ruolo anti-angiogenico delle MSCs, sia umane che murine, attivate da citochine pro-infiammatorie. Questo risultato identifica chiaramente, per la prima volta, l’endotelio come target delle MSCs durante il processo di immunosoppressione. Inoltre, abbiamo confermato il ruolo chiave di TIMP-1, sia nel secretoma umano che murino, come mediatore di tale effetto anti-angiogenico, (Maffioli E et al., 2017). I dati completi di spettrometria di massa sono disponibili tramite ProteomeXchange con l'identificatore PXD005746. Nonostante i trials clinici registrati che utilizzano le MSCs siano più di 600 in tutto il mondo (come riportato da www.clinicaltrials.gov), quest’approccio rimane ancora non completamente sviluppato e sicuro. Ad esempio, sono ancora mancanti sia un protocollo standardizzato per l’isolamento, il mantenimento in coltura e la via di somministrazione delle MSCs durante la terapia, che una standardizzazione dei parametri di qualità e sicurezza delle MSCs necessari per lo sviluppo di un efficiente terapia. Con lo scopo di superare queste problematiche, abbiamo volto la nostra attenzione su un approccio alternativo, potenzialmente più economico e sicuro, ovvero l’impego di derivati dalle MSCs, anziché direttamente le cellule stesse. Uno dei prodotti delle MSCs più studiati, e pertanto caratterizzati, sono le vescicole extracellulari (EVs) (Biancone L et al., 2012). Le EVs si originano dalla membrana plasmatica cellulare e vengono rilasciate dalle cellule come particelle lipidiche. Secondo le raccomandazioni della Società Internazionale per le vescicole extracellulari (ISEV), tali vescicole possono essere classificate in tre categorie principali sulle basi delle loro dimensioni, origini e metodi di isolamento,: (i) Microvesicole (dimensioni tra 50 e 1000 nm , originate dalla membrana plasmatica e arricchite in CD40); (ii) corpi apoptotici (dimensioni comprese tra 800 e 5000 nm, derivate da frammenti di cellule morenti e arricchite in istoni e DNA); e (iii) esosomi che sono piccole vescicole di origine endocitica (~ 30-120 nm) (arricchite da marcatori della membrana endosomale tardiva, compresi Tsg101, CD63, CD9 e CD81) (Yáñez-Mó, 2015). Diversi studi hanno riportato che le EVs provenienti da MSCs mostrano potenziali terapeutici simili a quelli delle loro cellule di origine (Merin-Gonzàles et al., 2016). Ad esempio, è stato dimostrato che le EVs di MSCs riducono la zona infartuata e migliorano la riparazione dei tessuti in malattie cardiovascolari (Lai et al., 2010). Più in generale, è stato riportato che le EVs derivanti da MSCs non stimolate possono ridurre la fibrosi e l'apoptosi, ma, contrariamente, sostenere la differenziazione delle cellule staminali, promuovendo così il processo di rigenerazione tissutale associato non solo a malattie cardiovascolari, ma anche lesioni renali, epatiche e polmonari (Sweta Rani et al., 2015). Pertanto, con il fine ultimo di sviluppare un’efficace terapia immunomodulante, abbiamo analizzato l’effetto delle EVs rilasciate da MSCs sull'angiogenesi. Per questo, abbiamo innanzitutto isolato e concentrato le vescicole dal terreno condizionato da MSCs attivate con citochine pro-infiammatorie. In seguito, abbiamo valutato la capacità di tali vescicole di controllare il processo di formazione dei tubuli in vitro mediante l’utilizzo di cellule endoteliali (SVEC4-10). I nostri dati hanno confermato che solo le vescicole derivate da MSCs stimolate inibiscono il processo di tubulogenesi, ricapitolando l'effetto anti-angiogenico osservato con l’intero terreno condizionato da st- MSCs. Anche in queste condizioni, TIMP-1 svolge un ruolo cruciale. Infatti, l’utilizzo di un anticorpo bloccante per TIMP-1 è stato in grado di annullare questo effetto anti-angiogenico. A conferma di ciò, l’analisi con Western blot ha evidenziato l’espressione di questo enzima unicamente su vescicole derivanti da MSCs stimolate con citochine pro-infiammatorie. Nel processo di tubulogenesi, la digestione del matrigel, sopra il quale vengono piastrare le cellule endoteliali e che mima la matrice extracellulare, rappresenta un processo essenziale per la formazione di una rete tubolare allungata e ben organizzata. TIMP-1, secreto da MSCs anche attraverso il rilascio di EVs, svolge un ruolo cruciale nell'inibizione di questo fenomeno, probabilmente bloccando l'attività delle metalloproteinasi necessaria per un’efficiente digestione del matrigel. Tuttavia, la migrazione delle cellule endoteliali rappresenta un altro passo fondamentale durante l'angiogenesi in vivo. Per studiare anche tale aspetto, abbiamo sfruttato un approccio sperimentale in vitro basato essenzialmente sulla capacità delle cellule di muoversi in uno spazio libero: il saggio di riparazione della ferita tissutale (Liang CC et al., 2007). L’esperimento consiste nel graffiare con un puntale un monostrato di cellule endoteliali (SVEC4-10) in modo da generare uno spazio vuoto nel quale esse possano liberamente migrare. Per valutare la capacità delle EVs di controllare la migrazione delle SVEC4-10, le cellule sono state trattate con vescicole provenienti dal surnatante di MSCs, stimolate e non con citochine pro-infiammatorie, e VEGF (un potente fattore pro-angiogenico), in presenza o in assenza dell’anticorpo bloccante per TIMP-1. Come previsto, il segnale pro-angiogenico (VEGF) aumenta la migrazione delle cellule endoteliali, mentre le EVs isolate dal terreno condizionato da MSCs stimolate, bloccano il processo. Tuttavia, in tale approccio sperimentale, l’inibizione di TIMP-1 non ha ripristinato la capacità migratoria delle cellule endoteliali, suggerendo, quindi, l’esistenza di un secondo meccanismo anti-angiogenico peculiare delle EVs provenienti da MSCs attivate. La capacità migratoria delle cellule endoteliali dipende massivamente dalla rapida riorganizzazione della rete actinica. In questo processo, le specie reattive dell’ossigeno (ROS) hanno un ruolo cruciale di regolazione, essendo in grado sia di sostenere che di bloccare l’angiogenesi. Tuttavia, il loro meccanismo d’azione rimane ancora controverso e sembra dipendere principalmente dalla loro localizzazione e, soprattutto, dalla loro concentrazione (Marcelo L. Lamers et al., 2011, Carlos Wilson et al., 2015). Infatti, basse concentrazioni di ROS supportano la fosforilazione del recettore del fattore di crescita VEGF (VEGF-R), e, di conseguenza, controllano positivamente l’attivazione del segnale a valle (Lamalice et al., 2007). Contrariamente, elevati livelli ROS inducono una disfunzione endoteliale, causando alterazioni nella loro capacità migratoria, induzione dell'apoptosi e attivazione di senescenza (Lum et al., 2001, Rong Liu et al., 2014). Per verificare un’implicazione dei ROS nell’inibizione delle capacità migratorie delle cellule endoteliali indotta dal trattamento con EVs derivanti da MSCs stimolate, abbiamo analizzato la loro produzione in tali cellule, attraverso l’utilizzo di una sonda generica per le specie reattive dell’ossigeno (H2DCFDA). Mediante questo approccio sperimentale abbiamo dimostrato che le EVs originate da MSCs stimolate con citochine sono in grado di aumentare la produzione di ROS nelle cellule endoteliali durante la migrazione. Questa evidenza ha supportato l’ipotesi che uno squilibrio ossidativo possa partecipare all'effetto anti-angiogenico indotto da EVs provenienti da MSCs stimolate con citochine pro-infiammatorie. Nox2 rappresenta il principale regolatore della produzione dei ROS nelle cellule endoteliali e l'adenosina è stata associata alla sua regolazione (Sapna Thakur et al., 2010). L’adenosina è generata tramite l’idrolisi dell’ATP (adenosina-5'-trifosfato) dagli enzimi CD39 (nucleoside trifosfato defosforilasi) e CD73 (ecto-5'-nucleotidasi). Inoltre, precedenti studi hanno dimostrato che le vescicole extracellulari possono esprimere questa coppia di enzimi (Clayton A et al., 2011, Schuler PJ et al., 2014, Amarnath S et al., 2015). Mediante Western Blot abbiamo, innanzitutto, verificato l'espressione di CD39 e CD73 in EVs provenienti da MSCs stimolate con citochine pro-infiammatorie. Inoltre, abbiamo dimostrato che l’utilizzo di entrambi gli inibitori ARL 67156 e AMP-CP, che bloccano rispettivamente CD39 e CD73, durante il saggio di riparazione della ferita tissutale, annulla l’effetto anti-angiogenico delle vescicole isolate da MSCs stimolate. Da tale risultato abbiamo, quindi, ipotizzato che le EVs derivate da MSCs attivate da citochine pro-infiammatorie, attraverso l’attività di CD39 e CD73, sono in grado di aumentare la concentrazione di adenosina extracellulare che, legando specifici recettori sulla superficie delle cellule endoteliali, induce l’attivazione di Nox2 e, consecutivamente, la produzione di ROS. A supporto di ciò, l'inibizione dell'accumulo di ROS, ottenuta mediante l’utilizzo di un antiossidante generico (NAC), ripristina totalmente la migrazione endoteliale. Per corroborare ulteriormente la nostra ipotesi, stiamo programmando di eseguire esperimenti per identificare il recettore specifico dell’adenosina coinvolto in questo processo e il meccanismo attraverso cui esso controlla l’accumulo di specie reattive dell’ossigeno. Al fine di sviluppare un approccio terapeutico da utilizzare a livello clinico, abbiamo convalidato i nostri risultati anche in vivo. Pertanto, abbiamo esaminato l'effetto anti-angiogenico delle EVs derivanti da MSCs stimolate da citochine pro-infiammatorie nel modello murino di vascolarizzazione della retina, un approccio sperimentale molto diffuso per lo studio del processo angiogenico in vivo (Andreas Stahl et al., 2010). Infatti, a differenza degli esseri umani, i topi presentano una rete vascolare retinica immatura alla nascita. La vascolarizzazione della retina, che si completa in alcune settimane, procede in modo strettamente regolato e organizzato, risultando così un modello efficiente per individuare eventuali difetti (Stahl et al., 2010). Così, topi C57BL / 6J sono stati iniettati intra-peritonealmente a un giorno di vita con EVs da MSCs, non stimolate o stimolate con citochine pro-infiammatorie, e sacrificati 5 giorni dopo per l’espianto delle retine. Mediante microscopia confocale, abbiamo osservato una diminuzione dell'arborizzazione vascolare della retina degli animali trattati con EVs provenienti da MSCs stimolate, ma nessun effetto con la controparte non stimolata. L’effetto anti-angiogenico di tali vescicole è stato ulteriormente corroborato mediante l’utilizzo di un altro modello murino: il saggio d’iniezione di un plug di matrigel. Quest’approccio consiste nella valutazione della vascolarizzazione del plug addizionato con EVs e impiantato nella parte dorsale posteriore di topi C57BL / 6-N. Anche tale modello ha confermato le proprietà anti-angiogeniche delle EVs derivanti da MSCs stimolate con citochine pro-infiammatorie. Collettivamente, tali evidenze suggeriscono la possibilità di sostituire le MSCs con i loro derivati, le EVs, per sviluppare un approccio terapeutico maggiormente standardizzabile e sicuro, senza l’impiego diretto di cellule. Successivi esperimenti saranno eseguiti per misurare la concentrazione di ROS nell’endotelio delle retine trattate con EVs derivanti da MSCs stimolate con citochine pro-infiammatorie. Inoltre, per validare il duplice meccanismo d’azione, utilizzeremo in vivo le EVs derivanti da MSC stimolate in cui è stato significativamente diminuita l’espressione di TIMP-1 (che abbiamo già ottenuto mediante siRNA) con o senza l’inibitore di CD39. Per concludere, i nostri dati indicano che le cellule staminali mesenchimali agiscono specificamente sulle cellule endoteliali per controllare l’infiammazione, anche mediante il rilascio di vescicole extracellulari. In particolare, questo è determinato dalla secrezione di fattori solubili, tra cui le EVs, che bloccano il processo angiogenico. Questa inibizione è mediata da almeno due meccanismi cooperanti che agiscono su due processi differenti, ma ugualmente fondamentali, dell’angiogenesi. Infatti, da un lato TIMP-1, espresso sulle vescicole, inibisce le MMPs, e, di conseguenza, influenza negativamente le capacità delle cellule endoteliali di degradare la matrice extracellulare circostante. D'altra parte, la produzione locale di adenosina, data della presenza di entrambi gli enzimi CD39 / CD73 sulla superficie di queste vescicole, induce l'attivazione di Nox2 e la produzione di ROS nelle cellule endoteliali, compromettendo così la loro motilità e proliferazione. Riteniamo che questi risultati siano di fondamentale importanza per comprendere pienamente il ruolo biologico delle MSCs e sfruttarle nella terapia. Infatti, i nostri dati confermano il concetto emergente di MSCs come sensori del microambiente, in grado di modulare gli eventi fisiologici e patologici. infatti, mentre in condizioni ipossiche le MSCs rilasciano vescicole che supportano il processo angiogenico (Consuelo Merino-González et al 2016, Gangadaran P. et al 2017, Jiejie Liuet al 2015, Suyan Bian et al., 2014), durante una risposta infiammatoria esse acquisiscono un fenotipo anti-infiammatorio, inibendo sia l'attività delle cellule immunitarie (Soraia C. Abreu et al., 2016, Claudia Lo Sicco ed altri 2017) sia l'angiogenesi ad essa associata (Angioni et al., manoscritto in preparazione, Maffioli et al.,2017, Zanotti and Angioni et al., 2016). Queste evidenze forniscono, pertanto, nuove prospettive per lo sviluppo d’importanti approcci terapeutici. Le EVs derivanti da MSCs stimolate da citochine pro-infiammatorie possono, infatti, rappresentare una terapia molto efficace per il trattamento dell'angiogenesi patologica per diverse ragioni: esse sembrano non soltanto agire selettivamente sull’endotelio, e inibire l'angiogenesi sfruttando meccanismi multipli, ma, in aggiunta, la terapia che ne potrebbe derivare avrebbe anche il grande vantaggio di essere più standardizzabile di quella basata sul trasferimento diretto di cellule.