COINVOLGIMENTO DEL RECETTORE-2 DI VEGF NELL'EFFETTO PRO-ANGIOGENICO INDOTTO IN CELLULE ENDOTELIALI UMANE DA AGONISTI DEL COMPLESSO RECETTORIALE CRLR/RAMP-2

In recent years, evidence has accumulated that many endogenous peptides play an important regulatory role in angiogenesis by modulating endothelial cell behavior. Adrenomedullin (AM), one such factors, was previously shown to exert a clearcut in vitro proangiogenic effect when tested on specialized human endothelial cells, such as HUVECs and immortalized endothelial cell lines. In our study we used normal adult vascular endothelial cells isolated from human saphena vein to analyze in vitro the role of AM related to both early (increase in cell proliferation) as well as late (differentiation and self-organization into capillary-like structures) angiogenic events and its relationship with the VEGF signaling cascade. The results indicated that also in this endothelial cell phenotype AM promoted cell proliferation and differentiation in cord-like structures. These pro-angiogenic actions resulted specific and mediated by the binding of AM to its AM1 (CRLR/RAMP2) receptor, as demonstrated by experiments performed on cells transfected with short interfering RNA inhibiting the expression of RAMP2 and, as a consequence, of a functional AM1 receptor. Furthermore, AM is not acting through an up-regulation of VEGF and/or its receptors, since no changes in the expression of these markers was detected (neither by RT-PCR nor immunocytochemistry) following AM administration. To further confirm these data, the effect of AM administration was studied in two different experimental conditions: i) in cells where the VEGF production was inhibited by gene silencing and ii) in the presence of a specific antagonist (V1) of the KDR receptor blocking the interaction of VEGF with that receptor. In both cases no significant reduction of the AM-induced effect on cell proliferation or capillarylike tube formation was observed. Interestingly, however, when the experiments were performed in the presence of SU5416 (a selective inhibitor of the VEGF-R2 receptor at the level of the intra-cellular tyrosine kinase domain) the proangiogenic effects of AM was abolished. This result suggests that in vascular endothelial cells the binding of AM to its AM1 receptor could trigger a transactivation of the VEGF-R2 receptor, leading to a signaling cascade inducing proangiogenic events in the cells. Immunocytochemical and Western blot data, obtained with antibodies raised against phosphorilated forms of KDR, seemed to confirm such an hypothesis. They suggested that AM administration could lead to the phosphorilation of KDR at Y951 and Y1175 phosphorilation sites, known to be involved in cellular responses such as proliferation, migration and cytoskeletal rearrangement. In order to further support these data another peptide was studied. This peptide, belonging to the calcitonin gene-related peptide's family and called Intermedin (IMD), shares with AM the same receptor system. The results indicated that IMD was also able to induce the phosphorilation of VEGF-R2 and a pro-angiogenic response in HSVECs. Altogether the results obtained suggest that in human endothelial cells there are alternative modes of activating the VEGF-dependent signaling cascade even in the absence of the trophic factor binding at the cell surface.

Questo lavoro di tesi si è focalizzato sul coinvolgimento del recettore-2 del VEGF nell'effetto proangiogenico indotto in cellule endoteliali umane da agonisti del complesso recettoriale CRLR/RAMP-2. Punto di partenza è stata la dimostrazione, ottenuta con svariati esperimenti di angiogenesi in vitro (Matrigel assay e test di proliferazione) effettuati su cellule endoteliali umane di vena safena (HSVEC), che un ligando endogeno di tale recettore, quale Adrenomedullina (AM), ha un ruolo di stimolazione dell'angiogenesi in vitro. Il coinvolgimento del complesso CRLR/RAMP2 nel mediare tale effetto è stato verificato con esperimenti eseguiti su cellule in cui è stata inibita l'espressione di RAMP2 mediante RNA interference. Inoltre, l'azione pro-angiogenica del peptide osservata sulle HSVEC non è risultata secondaria ad un incremento della produzione di VEGF o dei suoi recettori. L'esame dell'effetto di adrenomedullina sull'espressione dell' mRNA per VEGF, VEGFR1 e VEGFR2 non ha infatti evidenziato nessun cambiamento di espressione dell' mRNA per questi marker e sia il silenziamento genico del VEGF che l'uso di un antagonista di VEGFR2 (V1), non sono stati in grado di inibire l'effetto pro-angiogenico di adrenomedullina. L'utilizzo, invece, di SU5416, un potente inibitore dell'attività  tirosin chinasica di VEGFR2 è stato in grado di inibire anche l'azione di AM. Da ciò è stato ipotizzato che il legame di adrenomedullina al complesso CRLR/RAMP2 possa indurre una transattivazione del recettore VEGFR2 del VEGF. Questa ipotesi è stata confermata e supportata da esperimenti di immunocitochimica, immunofluorescenza e western blotting mirati a valutare la fosforilazione di VEGFR2 dopo stimolazione delle HSVEC con AM. Di ulteriore conferma sono stati i dati ottenuti con intermedina, un altro peptide appartenente alla famiglia del calcitonin gene-related peptide (CGRP), che agisce anch'esso attraverso i recettori derivati dalla dimerizzazione di CRLR e RAMP. Anche il trattamento con tale peptide è stato infatti in grado di indurre nelle HSVEC la fosforilazione di VEGFR2 e di produrre un'azione pro-angiogenica in vitro. L'insieme di tali esperimenti ha portato alla conclusione che agonisti del complesso recettoriale CRLR/RAMP2 (quali adrenomedullina e intermedina) siano in grado di indurre un effetto pro-angiogenico in cellule endoteliali umane sfruttando l'attività  tirosin chinasica del VEGFR2 e come quindi ci possano essere modi alternativi di attivazione della cascata del segnale VEGF-dipendente anche in assenza di legame del fattore trofico al suo recettore.