Synthesis and characterization of natural compounds derivatives for biological systems analysis: Topoisomerase I-DNA-camptothecin and protein kinase A-cyclic AMP complexes as case studies

The aim of the present work lies in the analylis of two biological important enzymes: Human TopoisomeraseI and Protein Kinase A. Human Topoisomerase I (Topo I) is one of the enzyme involved into the control of the replication of the cell through the management of the topology of DNA, in particular the DNA supercoiling. Top1 relaxs supercoiled DNA operating a break in only one strand of the DNA duplex; it plays a fundamental step in the replicative process of the cell. Due to its crucial role, great efforts were made to obtain inhibitors of this enzime in order to obtain potential anticancer drug. Camptothecin (CPT), a natural pentacyclic alkaloid and its derivatives are one of the more representative class of inhibitors of Topo I. These molecules are able to intercalate inside the covalent binary complex Top1-DNA forming a reversible ternary complex Top1-DNA-CPT more stable respect to the previous one. This enhanced stability lead to a dimished possibility to religate the open strand and to the begin of the apoptotic process, when the replicative fork approaches the complex. Several efforts were made to better understand the mechanism of action of the camptothecin. We thus decided to use a spectroscopic technique to study this system, the electron paramagnetic resonance (EPR), by which is possible to register the behaviour of a paramagnetic probe placed inside the system under investigation, in particular its different mobility. Several camptothecin derivatives bringing the nitroxide moiety were synthetized followed by the synthsis of spin-labeled derivatives of a DNA oligonucleotide strand containing an high affinity cleavage site fo the topoisomerase I enzyme. Biological tests of these molecules were also performed to evaluate the ability of them to interact with the enzyme. The Protein Kinase A (PKA) is a four-membered structure with two regulatory (R) and two catalytic (C) subunits which control a wide number of biological processes of the cell, such as lipid and sugar metabolism, gene expression, cell replication and apoptosis. It controls all these processes through the phosphorilation of other substrates, such as proteins, which in turn activates other substrates until the biological response is produced (such kind of domino reaction are called enzymatic “cascade”). The activity of the PKA is controlled by the cyclic adenosine monophosphate (cAMP), a second messenger synthesized from ATP in response of an exreacellular stimulus. Failure to keep PKA under control can have disastrous consequences, including diseases such as cancer. In fact, a study conducted in the University of Padua showed an abnormal concentration of one of the regulatory subunit (RII alpha) in gliomas affected cells. Thus, to further investigate this aspect, cAMP based probe was realized using rhodamine as fluorescent moiety.

Lo scopo del presente lavoro consta nell'analisi di due importanti enzimi: la Topoisomerasi I umana e la Protein Chinasi A. Le topoisomerasi sono un gruppo di enzimi deputati al controllo del superavvolgimento del DNA durante la fase di replicazione cellulare. La topoisomerasi I (sottoclasse B) espressa nell‟uomo e‟ in grado di rilassare il DNA attraverso il taglio di un singolo filamento ed il successivo scorrimento del filamento intatto senza consumo di ATP. Per il suo ruolo chiave nel controllo della replicazione cellulare la topoisomerasi e‟ stata presa in considerazione come possibile bersaglio per la cura di patologie implicanti una rapida (ed incontrollata) replicazione, quali le neoplasie. Tra gli inibitori più importanti di questo enzima, spicca sicuramente la camptotecina. Questa molecola svolge la propria azione stabilizzando il complesso binario DNA-enzima attraverso la formazione di un complesso ternario DNA-enzima-camptotecina. Il danno subentra quando avviene la collisione tra la forcella replicativa e il complesso ternario: il mancato riconoscimento tra i due sistemi sfocia nella successiva attivazione del programma di apoptosi. Uno degli aspetti più interessanti di questa molecola riguarda il suo meccanismo di azione. Per ottenere ulteriori informazioni abbiamo utilizzato la spettroscopia di risonanza di spin elettronico (ESR od EPR), dove viene eccitato e successivamente registrato lo spin dell‟elettrone. Sono stati dunque sintetizzati diversi derivati della camptotecina recanti una sonda paramagnetica (in questo caso, un nitrossido) e derivati nitrossido-marcati di una sequenza oligonucleotidica di DNA con un sito ad alta affinità per la topoisomerasi I. Vengono anche mostrati i saggi biologici realizzati per valutare la loro attività nei confronti dell’enzima. Le protein chinasi cAMP dipendenti (PKA) sono enzimi dipendenti dal secondo messaggero, il cAMP (3‟-5‟-adenosina monofosfato ciclico). Questi enzimi si presentano in forma di tetrameri composti de due subunità regolatorie (R) e due catalitiche (C); il cAMP lega le subunità regolatorie delle PKA e converte quest‟ultima nella conformazione attiva grazie alla quale è in grado di trasferire gruppi fosfato da una molecola donatrice quale l‟ATP a specifici substrati. Questo processo, definito fosforilazione, è alla base di numerosi processi metabolici cellulari, quali la trascrizione, il metabolismo, il ciclo cellulare, la differenziazione, la crescita, lo sviluppo e l‟apoptosi. Un’ incontrollata regolazione della PKA può portare all’ insorgenza di patologie gravi, tra cui anche il cancro. Uno studio recente condotto dall’Università di Padova ha infatti mostrato una anomala distribuzione di una della subunità regolatorie della PKA in cellule cerebrali affette da glioma. Per investigare più dettagliatamente questo aspetto, è stata realizzata una sonda basata sulla struttura AMP ciclica recante un fluoroforo facilmente misurabile quale la rodamina.