Discovering Sortases: From pilus biogenesis in Streptococcus pneumoniae to application in biotecnology

SUMMARY Gram-positive bacteria display various surface proteins on their cell wall, many of them performing virulence related functions, such as host surface attachment and immune system escape. Several of these exposed proteins are covalently linked to the peptidoglycan layer through the sortase-mediated transpeptidation mechanism. Sortases recognize protein substrates with a C-terminal LPXTG motif, cleaving the peptide bond between the motif’s threonine and glycine residues, forming a thioacyl intermediate. Transpeptidation proceeds by the nucleophilic attack by the N-terminus of the peptidyl side chain of a lipid II peptidoglycan precursor resulting in the formation of a protein-lipid II adduct (Ton-That and Schneewind, 1999). Incorporation of the protein-loaded lipid II into the peptidoglycan layer finally leads to covalent attachment of the sortase substrate to the cell wall. Sortases are also responsible for the polymerization of new virulence factors recently identified in Gram-positive bacteria known as Pili. Pili consist of covalently linked subunits assembled by specialized pilus-related sortases, phylogenetically and mechanisti¬cally related to housekeeping sortases that anchor proteins to the cell wall (Telford et al., 2006). Several studies describe pilus-like surface structures as eligible components for vaccine development; however, understanding the mechanism of pilus assembly in Gram positive bacteria is still rudimentary. To elucidate the role of pilus-related sortases, the human pathogen Streptococcus pneumoniae was used as a model system. This thesis describes the role of pilus-related sortases in biogenesis of pili encoded by a region known as Pilus islet 1 (PI-1). PI-1 related sortases of S. pneumoniae were functionally characterized using various biochemical methods. FRET (Fluorescent Resonance Energy Transfer) and HPLC-based sortase activity assays were developed allowing kinetic and mechanistic analysis and studying substrate specificity of PI-1 related sortases. In vivo studies were performed to confirm in vitro data. Furthermore, this thesis explores possible applications of sortases in biotechnology. Discovery of sortase-catalyzed transpeptidation lead to development of the Sortase tagging technology (Sortagging), a powerful tool to create functionalized protein-conjugates. Sortases may exert their activity in vitro in the presence of an LPXTG tagged protein and derivatized glycine compounds that act as nucleophiles to yield a functionalized transpeptidation product. Depending on the function carried by the glycine derivative, it is possible to obtain fluorescent labeled proteins, circularized proteins, covalently linked proteins or proteins that are covalently attached to a solid support. The housekeeping sortase A from S. aureus is extensively applied for these biotechnological purposes and it was also used for the novel biotechnological application described here. This thesis explores the application of sortase technology for the creation of protein arrays to be used in high throughput screening of protein-protein interactions. In this context, an Influenza virus protein array was developed to screen sera against the H1N1 virus. Bacterial crude extracts were applied to immobilize expressed LPETG-tagged Influenza virus proteins at their carboxyl-termini on pre-activated amine-glass slides derivatized with Gly3 peptide. The specificity of the Sortase A reaction permits avoiding purification steps in array building and allows for immobilization of proteins in an oriented fashion. This section of the work describes how, for the first time, sortagging was implemented to covalently link proteins of a viral genome to a solid support. This approach allows for scaling-up to proteins of larger genomes in order to develop a high density protein array to be used in high throughput screening.

SOMMARIO I batteri Gram positivi espongono sulla loro parete cellulare proteine di superficie, molte di queste hanno una funzione relativa alla virulenza del batterio stesso, tra gli esempi del loro ruolo ci sono l’evasione dal sistema immunitario o l’iterazione con la superficie dell’ospite. Diverse proteine di superficie sono legate covalentemente allo strato di peptidoglicano dei Gram positivi attraverso un meccanismo di transpeptidazione, enzimi responsabili di quenza reazione sono stati denominati sortasi. Le sortasi sono in grado di riconoscere un motivo C-terminal LPxTG, effettuando un taglio tra i residui aminoacidici di Thr e di Gly, in maniera tale da avere in un primo step di reazione la formazione di un intermedio che viene poi risolto in un secondo momento da un attacco nucleofilo mediato dall’N-terminal del peptydil side chain del Lipid II precursore del peptidoglicano (Ton-That et al., 1999). Oltre all’ancoraggio di proteine di superficie le sortasi sono responsabili della polimerizzazione di nuovi fattori di virulenza recentemente identificati in batteri Gram positivi e noti come Pili. I Pili consistono in subunità covalentemente legate e assemblate grazie alle sortasi associate al pilo, le quali sono filogeneticamente e maccanicisticamente vicine alle housekeeping sortasi il cui ruolo è quello di ancorare le proteine alla parete cellulare (Telford et al., 2006). Diversi studi descrivono queste strutture come componenti elegibili per lo sviluppo di un vaccino, sebbene il meccanismo di assemblaggio risulta ancora rudimentale. Per meglio chiarire il ruolo delle sortasi associate al pilo in questo lavoro di tesi si è preso come modello lo studio delle sortasi in S. pneumoniae. In questo studio viene descritto infatti il ruolo delle sortasi nella biogenesi del pilo di S. pneumonaie, codificato da una regione nota come Pilus islet 1 (PI-1). Le sortasi relative a questa regione sono state caratterizzate usando diversi metodi biochimici, tra cui saggi di FRET ( Fluorescent Resonance Energy Transfer) e saggi di attività basati su analisi HPLC. Questi studi hanno permesso di fare analisi cinetiche e di studiare la specificità di substrato delle diverse sortasi relativa alle subunità che compongono il pilo, ossia RrgB, RrgA e RrgC. Analisi in vivo hanno poi permesso di confermare i dati ottenuti dallo studio in vitro. Dopo questa prima sessione, in questo lavoro si sono anche valutate le possibili applicazioni biotecnologiche capaci di sfruttare l’attività biologica delle sortasi. Recentemente svariate applicazioni biotecnologiche hanno permesso di sfruttare la transpeptidazione per di funzionalizzare proteine, processo noto col nome di Sortagging. Infatti le sortasi esercitano la loro attività anche in vitro in presenza di una proteina substrato ricombinante, contenente un motivo LPxTG e composti derivatizzati con oligoglicine che agendo da nucleofili risolvono la reazione di transpeptidazione in un prodotto finito modificato e funzionalizzato. Attraverso il Sortagging è possibile ottenere proteine fluorescenti, circolarizzarle o covalentemente unirle a supporto solido o banalmente è possibile ricreare un legame peptidico tra proteine con prodotti ricombinanti opportunamente modificati col motivo LPxTG e con oligoglicine (e.Gly3). Per le suddette applicazioni è stata ampliamente utilizzata l’housekeeping sortase A di S. aureus che è anche stata impiegata in questa tesi. Obiettivo è quello di creare un protein array per high troughput screening capace di rilevare iterazioni proteina-proteina. In questo contesto un protein array del Virus Influenza è stato sviluppato per lo screening di siero commerciale H1N1. Lisati batterici che esprimono proteine dell’Influenza virus modificate al C-terminal con il mofivo sortagging sono state immobilizate su glass-slide opportunamente derivatizzate con Gly3. Grazie alla specificità della sortasi A è possibile utilizzare estratti crudi evitandodi step di purificazione e un’immobilizzazione orientata. É stato applicato per la prima volta il processo di Sortagging per legare proteine di un genoma intero su supporto solido. L’idea è quella di poter applpicare la tecnologia a un ampio proteoma in grado di sviluppare un protein microarray ad alta densità.