HCV interferisce con la via di segnale BMP6-SMAD e sopprime l'espressione di epcidina: risultatI in vivo ed in vitro

Background Chronic inflammatory states are often associated with anaemia that is attributed to increased levels of the iron regulatory hormone hepcidin. An exception is chronic hepatitis C virus (HCV) infection, which is accompanied by reduced hepcidin and predisposes to hepatic iron accumulation that exacerbates disease. Hepcidin synthesis by hepatocytes is largely controlled by bone morphogenetic proteins (BMP) and the SMAD signalling cascade. This pathway involves different factors: BMP6, emojuvelin (the BMP6 coreceptor), SMAD 1/5/8 (transcriptional factors) and the inhibitors SMAD6 and SMAD7 (which act through a negative feedback loop). Recently, BMP7 showed a synergistic effect with IFN-alfa in suppressing viral replication, in HCV+ cell cultures treated with both these drugs. So, our hypothesis is that HCV could influence the BMP6-SMADs signalling, in order to antagonize the possible antiviral effect of BMP6; in this case, low expression of hepcidin in HCV infection should be only a secondary event, given that hepcidin is the main target gene of the BMP6-SMADs pathway. Materials and Methods We assessed mRNA quantification by qRT-PCR for mRNA encoding hepcidin, emojuvelin, BMP6, SMAD6 and SMAD7 in biopsies obtained from HCV chronically infected patients, before antiviral treatment. We compared the gene expression in HCV+ patients vs controls and in non responders vs responders to antiviral therapy. We confirmed the in vivo results by an in vitro viral replication model of HCV infection. Results In vivo We found altered gene expression of components of the BMP6-SMADs pathway in liver biopsies from HCV positive patients: HCV positive patients showed significantly low levels of hepcidin and high levels of SMAD6 and SMAD7 in comparison to controls. Pre-treatment biopsies from patients non-responsive to antiviral therapy showed reduced levels of the BMP co-receptor HJV (p=0.0027), reduced levels of both the BMP target genes hepcidin (p=0.008) and ID1 (0.05). In vitro An in vitro virus replication model showed similar alterations in BMP pathway gene expression, and HCV infected cells exhibited a blunted hepcidin response to BMP6. BMP pathway inhibition was caused at least in part by virally-induced TNF-alpha. TNF-alpha suppressed induction of hepcidin by BMP and neutralizing anti-TNF-alpha antibodies restored the response to BMP6 by HCV+ infected cells. Conclusions HCV interferes with the BMP6/SMAD1/5/8 pathway both directly and indirectly, through the enhancement of TNF-α. The identification of BMP signal inhibition by HCV that correlates with hepcidin suppression and treatment response suggests new options for antiviral therapy.

Razionale Lo stato di infiammazione cronica è spesso associato ad anemia attribuita all’incremento dell’epcidina, ormone regolatore dell’assorbimento del ferro. L’epatite cronica C rappresenta un’eccezione, essendo accompagnata da ridotta espressione di epcidina e predisposizione all’accumulo di ferro. La sintesi di epcidina da parte degli epatociti, che ne rappresentano la fonte primaria, è largamente controllata da proteine dette BMPs (Bone Morphogenetic Proteins), in particolare il BMP6. Nella via sono implicati altri fattori quali l’emojuvelina, corecettore del BMP6, i fattori trascrizionali SMAD1/5/8, ed i fattori inibitori SMAD6 e SMAD7, che, indotti in risposta all’attivazione della via di segnale stessa, inibiscono l’espressione di epcidina, con un feedback negativo. L’importanza dello studio del ruolo dei BMP è sostenuta dal fatto che recentemente BMP7 ha presentato in uno studio in vitro un effetto sinergico con IFN-α, per aumentare l’effetto antivirale e sopprimere la replicazione virale. Si potrebbe ipotizzare, perciò, che il virus dell’epatite C, per contrastare fattori che hanno effetto antivirale, produca come evento collaterale la riduzione di espressione di epcidina, che solo in alcuni casi (compresenza di altri fattori predisponenti genetici, comportamentali, ambientali) potrebbe portare all’accumulo di ferro. Materiali e metodi Con metodica qRT-PCR è stata quantificata l’espressione di emojuvelina, epcidina, BMP6 e SMAD in mRNA proveniente da biopsie ottenute da pazienti HCV positivi, prima di qualsiasi trattamento antivirale e controlli non epatopatici. Inoltre, è stato fatto un confronto tra pazienti HCV positivi con Sustained Virological Response (SVR) e pazienti Non Responders a terapia antivirale. E’ stato poi allestito un modello in vitro con cellule di epatoma infette e non infette, per confermare i dati ottenuti in vivo. Risultati In vivo: L’espressione di epcidina era significativamente ridotta nei pazienti HCV positivi rispetto ai controlli non epatopatici (p=0.002), mentre quella di SMAD6 (p=0.008) e SMAD7 (p=n.s.) era aumentata. L’espressione del gene dell’epcidina e di ID1, target della via di segnale di BMP6/SMAD1/5/8, era significativamente ridotta nei pazienti NR confrontati coi pazienti SVR (rispettivamente p=0.008 e p=0.05), come anche quella di emojuvelina (p=0.0027). In vitro: I risultati in esperimenti su colture cellulari hanno confermato alterazioni simili a quelle ottenute in vivo riguardo all’espressione dei geni coinvolti nella via di segnale analizzata: cellule infette con HCV erano meno sensibili all’azione del BMP6, in termini di espressione di epcidina. L’inibizione della via di segnale in presenza di infezione da HCV era dovuta, almeno parzialmente, all’azione del TNF-α. Il TNF-α sopprimeva l’induzione di epcidina da parte di BMP6, mentre anticorpi anti-TNF-α ripristinavano la risposta cellulare a BMP6 in colture infettate. Conclusioni Il virus dell’epatite C interferisce con una nuova via di segnale: la via attivata dal BMP6, coinvolgente i fattori trascrizionali SMAD1/5/8, cruciale nella regolazione dell’espressione di epcidina, ormone regolatore del metabolismo del ferro nell’organismo. Il virus HCV inibisce la via di segnale sia direttamente che indirettamente, attraverso produzione di TNF-α. La comprensione dell’interazione tra HCV e i fattori implicati nella via di segnale BMP6/SMAD1/5/8 è importante anche per definire eventuali nuovi target terapeutici in corso di infezione da HCV.