Targeting delle vie metaboliche dell'Epidermal Growth Factor (EGF), Adrenomedullina (ADM) ed Endotelina (ET-1) nelle linee stabilizzate di leucemia mieloide acuta (LMA)

ABSTRACT Outcome among Acute Myeloid Leukaemia (AML) patients did not undergo a significant improvement despite the more and more careful overview of the pathogenetic mechanisms those are involved in neoplastic transformation of haematopoietic stem cell. Cell maturation arrest is the distinguishing feature of each acute leukaemia and probably the presence of a very low rate of immature cells is responsible for chemoresistance and relapse. Perspective to utilize pharmacological approaches to overcome cell maturation arrest is rather attractive and it is encouraged by the success obtained in Acute Promyelocytic Leukaemia with the introduction of all-trans-retinoic acid in medical trials. Concerning this aim, an in vitro experimental model was proposed. It utilizes LMA stabilized cell lines, especially KASUMI-1, from German cell bank DSMZ and three HL-60 cell lines (HL-60 TV from University of Padova, HL-60 CRO from the CRO Institute of Aviano-Italy and HL-60 BANCA from DSMZ German bank), peptides ADM and ET-1 and their own inhibitors (ADM-fragment22-52, BQ123 and BQ788) and Epidermal Growth Factor-EGF and its indirect inhibitor (Gefitinib) at different concentrations. Cell lines were immunophenotypic and immunocytochemistry characterized. These analysis suggested differences among cell lines under all points of view even in duplication time during growth cell. This could explain that contrasting results you can find in Literature could arise from cell lines utilized in different laboratories. These cell lines could significantly differ in their biological characteristics presenting possible clonal selection mechanisms that could have possible effects on pharmacological stimulus responses. Experiments were carried out in parallel on all cell lines exposing them to decreasing doses of ADM, ET-1 (5x10-8 M, 2.5x10-8 M, 1.25x10-8 M, 0.625x10-8 M) and EGF (10 mg/microl, 5 mg/microl, 2.5 mg/microl, 1.25 mg/microl). The time of exposure (24h, 48h, 72h) was also considered. Results show a stimulating power of all peptides with regards to doses and time of exposure. Minimal differences were observed among different cell lines. The effects exerted by these peptides were confirmed with the results obtained utilizing their own inhibitors. ADM-fragment22-52 does not exert any effect on cell lines by itself, but it blocks off ADM proliferation induction effects in association with this peptide. At the same way, ET-1 inhibitors BQ123 and BQ788 do not exert any effect on cell lines and they reverse the inductive power of ET-1 on all stabilized AML cell lines. Gefitinib has in vitro anti-proliferation activity with cytotoxic and cytostatic effects at therapeutic doses reached in its clinical use, especially in the treatment of epithelial origin neoplasia. And it also has a clinical significance on LAM treatment, even if it is not possible to observe and prove morphologically and immunophenotypically myeloid maturation. This investigation was carried out by a preliminary investigation which was based on short-term cytotoxic tests connected with recovery test on semisolid medium, on morphologic and immunophenotype analysis. The microscopic observation confirm these results, but they underline that the anti-proliferation activity of Gefitinib is dose-dependent and it is show in different modalities among cell lines. Moreover, statistical analysis, elaborated for short-term cell culture assays, proved that DMSO, used as solvent for the drug, exerts an anti-proliferation activity on cell lines. Long-term effects exerted by Gefitinib were tested with a Colony Forming Unit (CFU) assay in a semisolid medium. The mean CFU number grown up post exposition to drug was considered. Morphological observations carried out on preparations set up at the end of the short-term cell culture assays exposed to low dose of the drug did not showed any segmentation or/and banded phenomenon on myeloid cells nuclei. As we know, these fragmentation phenomenons are typical of the myeloid differentiation pathway. Cytometric analysis, too, did not evidence phenotypically alterations of different cell lines after exposure to drug. The role of C/EBAalfa on commitment and differentiation of haematopoietic stem cells through granulocyte cells is essential. C/EBAalfa is a protein of the bzip (basic leucine zipper protein) transcription factors family, that is able to form homodimers and heterodimers with other C/EBP protein family and to trans-activate target genes (G-CSF receptor) transcription. The main function of this protein is the balance between cell proliferation and differentiation controlling the haematopoietic stem cell pool self-renewal. If C/EBAalfa is the common denominator in patients affected by Acute Myeloid Leukaemia (with or without associated chromosomal alterations), therapeutical strategies headed to correct this pathway could be very interesting. The C/EBAalfa gene expression was evaluated by Real Time PCR in HL-60 TV cell line at the basal time, after short-term incubation time with 2.5 microM Gefitinib (the highest drug-dose able to give cytostatic but not cytotoxic effect). Relative controls, cell line incubated with DMSO and with culture medium alone, were also considered in these analysis. Similarly to morphological and immuno-phenotypically observations Gefitinib does not induce up-regulation of C/EBAalfa gene expression. These data suggest that ADM and ET-1 concur to LMA cell lines proliferation. This effect was blocked by relative inhibitors. EGF does not exert any effect on cell lines. According to these findings it is possible to consider ADM and ET-1 as two new promising regulatory molecules involved in haematopoietic pathways.

RIASSUNTO L’outcome della leucemia mieloide acuta (LMA) non ha subito significativi miglioramenti nonostante la sempre più accurata descrizione dei meccanismi patogenetici che sottendono la trasformazione neoplastica della cellula staminale ematopoietica. Il blocco maturativo è caratteristica distintiva di tutte le leucemie acute e verosimilmente la presenza di una quota minoritaria di cellule a fenotipo più immaturo è responsabile di chemioresistenza e relapse. La prospettiva di poter utilizzare strategie farmacologiche volte a superare il blocco differenziativo, incoraggiata dal successo ottenuto nella leucemia acuta promielocitica con l'introduzione nei protocolli di terapia dell'acido all-trans retinoico, diventa alquanto attraente. Con questo obiettivo è stato proposto un modello sperimentale in vitro che vede l’utilizzo di linee cellulari stabilizzate di LMA, in particolare KASUMI-1 provenienti dalla banca tedesca DSMZ, tre ceppi HL-60 (HL-60 TV dall’università di Padova, HL-60 CRO dall’ospedale CRO di Aviano e HL-60 BANCA dalla banca tedesca DSMZ), dei peptidi Adrenomedullina (ADM), Endotelina-1 (ET-1) e dei loro rispettivi inibitori (ADM-fragment22-52 inhibitor, BQ123 e BQ788), del fattore di crescita dell’epidermide (EGF - Epidermal Growth Factor) e del suo inibitore indiretto (Gefitinib) a diverse concentrazioni. Tutti i ceppi HL-60 e la linea KASUMI-1 sono stati caratterizzati da un punto di vista immucitochimico e immunofenotipico. Queste analisi hanno evidenziato una diversità tra i ceppi sotto tutti i profili, anche nel tempo di duplicazione durante la crescita. Questo spiegherebbe il fatto che risultati discordanti in letteratura potrebbero essere originati da ceppi cellulari utilizzati nei diversi laboratori che possono differire anche in maniera significativa nelle loro caratteristiche biologiche, con eventuali meccanismi di selezione clonale e possibili ripercussioni sulla risposta allo stimolo farmacologico. Gli esperimenti sono stati condotti in parallelo su tutte le linee esponendole a concentrazioni decrescenti di ADM (5x10-8M, 2.5x10-8M, 1.25x10-8M e 0.625x10-8M; ET-1 (5x10-8M, 2.5x10-8M, 1.25x10-8M e 0.625x10-8M) ed EGF (10mg/microl, 5mg/microl, 2.5microg/ml e 1.25microg/ml). Il processo è stato valutato anche in relazione al tempo: 24h, 48h e 72h di esposizione. I risultati mostrano un potere stimolante di tutti e tre i peptidi in relazione alla dose e al tempo di somministrazione, con minime differenze tra i ceppi utilizzati. Gli effetti dei peptidi sono stati confermati dai risultati ottenuti utilizzando i loro rispettivi inibitori. ADM-fragment22-52 Inhibitor non esercita alcun effetto sui ceppi HL-60 e sulla linea KASUMI-1 singolarmente ma accoppiato ad ADM ne blocca la capacità proliferativa: gli effetti inducenti di ADM sono annullati dall’aggiunta ai terreni di coltura del corrispettivo inibitore. Allo stesso modo gli inibitori BQ123 e BQ788 dell’Endotelina da soli non esercitano alcun effetto sulle cellule mentre annullano il potere inducente di ET-1 in tutte le linee stabilizzate di LMA. Gefitinib esplica in vitro attività antiproliferativa con effetto citossico e citostatico a concentrazioni terapeuticamente raggiunte nell'attuale impiego clinico del farmaco, in particolare nel trattamento delle neoplasie di origine epiteliale. Questa indagine è stata effettuata mediante una sperimentazione preliminare articolata su test citotossici a breve termine associati a test di recupero in terreno semisolido e su indagini morfologiche ed immunofenotipiche. Le osservazione microscopiche confermano tali risultati, ma evidenziano che l’attività antiproliferativa di Gefitinib è dose dipendente e si realizza con modalità differenti nei diversi ceppi. Nei saggi colturali a breve termine, l’analisi statistica ha rivelato che anche il DMSO utilizzato come solvente del farmaco esercita una azione antiproliferativa. Gli effetti a lungo termine del Gefitinib sono stati testati come numero medio di CFU sviluppatesi post esposizione al farmaco in un terreno semisolido uguale per tutti i dosaggi. Le osservazioni morfologiche condotte su preparati allestiti al termine dei saggi colturali a breve termine non evidenziano, ai dosaggi più bassi, alcun fenomeno di segmentazione e/o banded a carico dei nuclei, tipico della differenziazione del promielocita in mielocita, metamielocita e granulocita maturo che caratterizza il processo di maturazione di questa filiera ematopoietica. Anche le indagini citofluorimetriche non mostrano variazioni qualitative del fenotipo di tutti i ceppi, post esposizione al farmaco. Essenziale per il commitment e lo sviluppo emopoietico in senso granulocitario è il ruolo esercitato da C/EBPalfa proteina appartenente alla famiglia dei fattori di trascrizione bzip (basic leucine zipper protein), in grado di formare omodimeri o eterodimeri con altre proteine C/EBP e attivare così la trascrizione di geni target (G-CSF receptor). La principale funzione di questa proteina sembra essere quella di bilanciare la proliferazione e la differenziazione cellulare regolando il self-renewal del pool staminale ematopoietico. E’ chiaro che se C/EBPalfa rappresenta un comune denominatore in pazienti affetti da leucemia acuta mieloide (con o senza alterazioni cromosomiche associate), strategie terapeutiche dirette alla correzione di questo pathway possono rappresentare una razionale prospettiva terapeutica. Per questo motivo sono stati iniziati degli studi sul ceppo HL-60 TV con metodica Real Time PCR sulle cellule in condizioni basali, dopo incubazione a breve termine con Gefitinib alla concentrazione di 2.5microM (la più alta in grado di dare effetto citostatico, ma non citotossicità) e nei controlli incubati con DMSO e in coltura di mantenimento. Consensualmente alle osservazioni morfologiche ed immunofenotipiche, Gefitinib non induce up-regolazione di C/EBPalfa. Pertanto, questi dati, se considerati nel loro complesso, suggeriscono che ADM ed ET-1 contribuiscono alla proliferazione delle cellule di LMA, azione fortemente ridotta dai rispettivi inibitori, mentre EGF esercita minimi effetti induttivi sulle cellule. Alla luce di tali considerazioni è possibile ritenere che AM ed ET-1 siano due nuove promettenti molecole regolatorie dei processi ematopoietici.