SNARE complexes associate in a rosette-like structure at the Drosophila neuromuscular junction

Secretion in all eukaryotic cells involves a family of proteins known as SNAREs (soluble Nethylmaleimide‐sensitive factor attachment protein receptors). In the nervous system, these proteins are the main molecular constituents of the synaptic vesicle fusion machinery. The release of molecules contained inside exocytic granules and synaptic vesicles is mediated by the assembly of a four helix bundle complex: the SNARE complex. It is formed by the coilcoiling of three proteins: the v‐SNARE VAMP/Synaptobrevin and the t‐SNAREs, Syntaxin and SNAP‐25 (synaptosome‐associated protein of 25 kDa). A cooperative interaction between SNARE complexes has been suggested to be necessary for the fusion of a synaptic vesicle with the presynaptic membrane to occur. Previous experiments, made with botulinum neurotoxins type A and E on mouse neuromuscular junction, led to predict a central role of the SNAP‐25 C‐terminus in protein‐protein contacts between SNARE complexes. Previously conducted sequence comparisons and molecular dynamics simulations, led to the finding that this central role in such interactions could be played by a key Arginine residue at the SNAP‐25 C‐terminus. In particular, the SNAP‐25 Arg206 residue possibly forms an ionic bond with a negative charge amino acid of Syntaxin from an adjacent SNARE complex. A computational model, based on such interactions, proposes that the formation of the vesicle/presynaptic membrane fusion pore is catalyzed by a SNARE supercomplex consisting in a "ten petal" rosette. This prediction was tested in Drosophila melanogaster by altering the putative key amino acids, thought to be involved in rosette formation, by site‐directed mutagenesis. Two transgenic lines (harboring the mutation bearing constructs in a SNAP‐25 wild‐type background) were thus generated: UAS‐SNAP‐25WT (control) and UAS‐SNAP‐ 25R206A. Using the UAS/GAL4 system the expression of these constructs was directed specifically in the nervous system. The mRNA expression profiles, the locomotor behaviour and the morphology of the neuromuscular junction of these mutants were characterized in third instar larvae. Electrophysiological recordings performed at the larval neuromuscular junction showed that the ElavALl4/UAS‐SNAP‐25R206A mutants present a decrease in the probability of vesicle fusion as compared to ElavGAL4/UAS‐SNAP‐25WT, our control, in both spontaneous and evoked exocytosis. These findings highlight the key role of Arg206 and support the model entailing the involvement of a rosette of SNARE complexes in the process of neuroexocytosis.

L’esocitosi regolata è un processo essenziale in tutte le cellule eucariotiche. A livello della sinapsi, il rilascio di molecule contenute all’interno delle vescicole è mediato dalla formazione del complesso SNARE, costituito dall’interazione di tre proteine: sintassina, SNAP‐25 e VAMP/sinaptobrevina. Numerose evidenze sperimentali suggeriscono che la cooperazione tra complessi SNARE adiacenti sia necessaria affinché una vescicola sinaptica si fonda con la membrane plasmatica. Da un’analisi della sequenza amminoacidica dell’isoforma neuronale di questa proteina è emerso che, nella porzione C‐terminale, un residuo aminoacidico è altamente conservato anche se non è situate nella regione di interazione tra SNAP‐25 e le altre componenti molecolari del complesso. In mammifero, tale residuo è l’arginina in posizione 198. Esperimenti condotti incubando la giunzione neuromuscolare di topo in presenza della tossina botulinica di tipo A hanno evidenziato il ruolo chiave della porzione C‐terminale della proteina SNAP‐25 nel processo di fusion vescicolare e, in particolare, dell’Arg198, poiché la tossina taglia esattamente la proteina a monte di questo residuo, determinando il blocco dell’esocitosi. Inoltre, simulazione di modeling effettuate al computer hanno suggerito che tale arginine interagisce con un amminoacido carico negativamente posizionato sulla sintassina del complesso SNARE adiacente, formando di un legame ionico. Questa ipotesi è stata verificata in vivo usando Drosophila melanogaster come organismo modello. Poiché nel moscerino della frutta la sequenza di SNAP‐25 è più lunga di quella in mammifero, l’arginina conservata risulta essere in posizione 206. Tale Arg206 è stata sostituita con un’alanina mediante mutagenesi sitospecifica. Quindi, sono state generate due linee transgeniche in cui i costrutti pUAST‐SNAP‐25WT e pUAST‐SNAP‐25R206A sono stati inseriti in background SNAP‐25 wild‐type. Sfruttando il sistema GAL4/UAS, i transgeni sono stati espressi nel sistema nervoso utilizzando il driver pan‐neuronale ElavGAL4. In entrambe le linee ElavGAL4/UAS‐SNAP‐25WT (controllo) (controllo) e ELAV‐GAL4/UAS‐SNAP‐25R206A (mutante) sono stati quantificati i profili di espressione dell’mRNA dei trascritti mutante e wild‐type; inoltre, è stata caratterizzata la giunzione neuromuscolare a livello larvale, musurandone la morfologia e la morfometria. L’analisi elettrofisiologica del rilascio spontaneo ed evocato ha mostrato una significativa riduzione della probabilità di fusione tra vescicola e membrana plasmatica. Questo risultato conferma il ruolo chiave ricoperto dall’Arg206 durante il processo di esocitosi a livello del terminale sinaptico e supporta l’ipotesi secondo cui i complessi SNARE cooperano tra loro, formando un supercomplesso necessario alla formazione del poro di fusione.