INGEGNERIA DEI TESSUTI E CELLULE STAMINALI ADULTE. TECNICHE PER LA RICOSTRUZIONE IN VITRO DI TESSUTI GHIANDOLARI

The aim of the first part of the PhD was the study and the improvement of the in vitro differentiation conditions of pluripotent human liver stem cells, HLSCs, into hepatocytes. After the evaluation that these cells cultivated in collagen sponge and in static conditions do not allow a good distribution in all the scaffold and that cells remain in a indifferential status, dynamic cultures were performed by using a bioreactor to assure a correct medium perfusion. Moreover, we performed co-coltures of HLSCs with hepatic stellate cells (Ito) in a medium for hepatocytes and in a medium for stem cells to investigate how the variation of a medium can influence the stem condition of cells. Morphological, histological, cells proliferation and genic expression analysis demonstrated how the use of a bioreactor and the employment of a stem cells medium, guarantee first of all HLSC’s organization in typical liver clusters up to the sponges deepest layers and the increase of the functional differentiation in a population of mature hepatocytes. In the second part of the PhD, the in vitro stem cells differentiation in Langerhans Islet by using biomaterials was studied. During the first step of the study we used Beta cells in order to understand in which form of benzilic ester scaffold cells can grow better. The more appropriate conditions concerns the use of sponges. However, cells showed a low proliferation rate and so we used Mesenchymal Stem Cells (MSC). Co-coltures of MSC with Beta cells by using different medium are still in progress to evaluate the differential status of Mesenchymal Stem Cells.

Nella prima parte del dottorato è stato effettuato lo studio e il miglioramento delle condizioni del differenziamento in vitro di cellule staminali pluripotenti presenti nel fegato, le HLSC, in senso epatico. Dopo aver valutato che la semina in condizioni statiche di tali cellule in spugne di collagene non permetteva una buona distribuzione in tutto lo scaffold e queste rimanevano per lo più indifferenziate, sono state effettuate delle colture dinamiche utilizzando un bioreattore per garantire una corretta perfusione del terreno di coltura. Inoltre sono state effettuate sia delle co-colture di HLSC con le cellule Ito del fegato sia semina in un terreno normalmente utilizzato per la coltura di epatociti e in un medium per cellule staminali, per valutare come la variazione di un terreno di coltura potesse influire sulla staminalità delle cellule. Sono state effettuate analisi morfologiche, istologiche, di proliferazione cellulare e di espressione genica delle colture. Queste hanno dimostrato come l’utilizzo di un bioreattore e di un terreno per cellule staminali possa permettere l’organizzazione delle HLSC in clusters tipici del fegato fino a strati profondi della spugna e l’aumento del differenziamento funzionale in una popolazione di epatociti maturi. Un’altra parte del dottorato è stata improntata nello studio del differenziamento in vitro di cellule staminali in Isole di Langerhans all’interno di biomateriali. Durante una prima fase di studio si sono utilizzate cellule Beta del pancreas per capire in quale forma di scaffold a base dell’estere benzilico dell’acido ialuronico potessero crescere meglio. La situazione migliore riguardava l’uso di spugne. Avendo però le cellule una scarsa capacità proliferativa, si è deciso di utilizzare come alternativa le Cellule Staminali Mesenchimali (MSC) e sono state effettuate prove di co-colture con cellule Beta utilizzando terreni diversi per valutare lo stato differenziativo delle MSC. Tali prove sono ancora in corso.