Understanding the mechanism of CREB overexpression in pediatric acute myeloid leukemia

Currently, acute myeoid leukemia (AML) is one of the cancer for which only about half of children and young adults are cured of this disease. Most patients with AML achieve remission after therapy, but nearly half of these patients experience relapse. In addition, despite improvements in supportive care, treatment-related morbidity and mortality remain significant problems. Therefore, the overall goal of current AML programs for children and young adults is to explicate the mechanism of leukemogenesis discovering other oncogenes and molecular targets and to develop novel therapies that overcome drug resistance, decrease relapse rates, and reduce the short- and long-term adverse effects of treatment (1). Recently, the cAMP response element (CRE) binding protein (CREB) has been demonstrated to be overexpressed in the 66 % of leukemic blast cells from patients with AML and in the 84 % of patient with acute lymphoid leukemia (ALL) compared to normal bone marrow or remission samples. CREB overexpression was also associated with a worse prognosis in CREB overexpressing AML patients (2,3). The mechanism of CREB overexpression in leukemia was investigated. First, we analyzed ICER, the endogenous repressor of CREB, and its role in regulating CREB-dependent transcription and its involvement in increasing chemotherapy induced apoptosis in leukemic cell after its forced exogenous expression. ICER was found downregulated in AML cell lines, displaying an inversed correlation with CREB expression. Initially we focused on restored ICER expression in cell lines able to decrease CREB protein and to lower clonogenic potential in vitro. In vivo, ICER was able to decrease the extramedullary sites invasion and overall angiogenesis in NOD-SCID mice tail vein injected with HL60 overexpressing ICER, demonstrating therefore it’s effect as a suppressor of tumor progression. ICER was found to repress the majority of CREB targets binding on the same sites of interaction on DNA, the CRE motif. An explanation for ICER down regulation in leukemia was found showing that ICER is subjected to degradation through a constitutively active form of the extracellular signal-regulated protein kinase (ERK), upregulated in leukemia and maintained by CREB, which drives it to the proteasome. We then focused on ICER’s role in the control of genes involved in apoptosis and MAPK signaling. ICER was found to confer cell enhanced sensibility to drugs when treated with chemotherapics, reducing cell growth and enhancing apoptotic behavior after chemotherapy treatment. A significant lowered expression of CREB target genes involved in cell cycle control (CyA1,B1,D1), and in the MAPK signaling pathway (ERK, AKT, DUSP1/4) was documented. The dual-specificity phosphatases DUSP1 and DUSP4, directly repressed by ICER, through p38 pathway were identified as main effectors of the enhanced apoptosis. This pathway was confirmed by using p38 directed drugs. The silencing of DUSP1/4 in HL60 confirmed the same enhanced drug sensitivity as established in HL60+ICER. Moreover primary AML cultures showed the same effect. Given the fact that overexpression of CREB protein did not correlate closely with CREB mRNA levels, suggested that posttranscriptional mechanisms may contribute to its elevated expression in leukemia (4). MicroRNAs that target CREB were identified and investigated as negative regulator of CREB expression. RQ-PCR revealed that miR-34b was expressed significantly less in myeloid cell lines and in AML bone marrow compared to bone marrow controls, showing a inversely correlation with CREB expression. In vitro experiment confirmed the direct regulation of miR-34b on CREB 3’untranslated region, resulting in a reduced CREB protein expression. MiR-34b restored expression caused cell cycle abnormalities, reduced anchorage independent growth, and altered CREB target gene expression, therefore suggesting its role as tumor suppressor. The miR-34b/34c promoter was demonstrated to be hypermethylated in leukemia cell lines, explaining a mechanism of miR-34b down regulation. Then, we further explored the molecular basis of miR-34b as tumor suppressor in AML samples. Primary cultures transiently overexpressing miR-34b showed decreased clonogenicity and increased apoptosis in vitro, while in vivo miR-34b overexpression in leukemic cell lines downregulated CREB levels, unveiled a reduced leukemia progression in NOD-SCID IL2Rγ null (NSG) mice. Hypermethylation of miR-34b promoter was demonstrated in 65.5 % (74/113) of AML patients, and correlated with elevated CREB protein levels. Bone marrow cells from 49 patients with myelodysplasia (MDS) or juvenile myelomonocytic leukemia (JMML) werefound unmethylated at miR-34b promoter, and CREB expression was not detectable. Three patients with (MDS) that evolved to AML had miR-34b promoter hypermethylation exclusively at the onset of AML. The role of miR-34b/CREB in the evolution of MDS to AML was then analyzed by lowering miR-34b expression in primary healthy samples. Increased CREB levels and upregulation of its target genes expression resulted in increased myelopoiesis and clonogenic capability. Taken together, these results suggest the important role that ICER cover in regulating CREB transcription and in the chemosensitivity to drugs and suggest that the miR-34b hypermethylation, throu controlling CREB expression, is a critical process for AML pathogenesis widening the set of pathway that can be addressed for the development of new cancer therapies. BIBLIOGRAPHY 1. Rubnitz JE. Childhood acute myeloid leukemia. Curr Treat Options Oncol. 2008 Feb;9(1):95-105. Epub 2008 May 28. Review. PubMed PMID: 18506629. 2. Shankar DB, Cheng JC, Kinjo K, Federman N, Moore TB, Gill A, Rao NP, Landaw EM, Sakamoto KM. The role of CREB as a proto-oncogene in hematopoiesis and in acute myeloid leukemia.Cancer Cell. 2005 Apr;7(4):351-62. PubMed PMID: 15837624. 3. Pigazzi M, Ricotti E, Germano G, Faggian D, Aricò M, Basso G. cAMP response element binding protein (CREB) overexpression CREB has been described as critical for leukemia progression.Haematologica. 2007 Oct;92(10):1435-7. PubMed PMID: 18024382. 4. Wong A, Sakamoto KM. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor induces the transcriptional activation of egr-1 through a protein kinase A-independent signaling pathway. J Biol Chem. 1995 Dec 22;270(51):30271-3. PubMed PMID: 8530445.

Solo la metà dei pazienti in età pediatrica riesce a guarire dalla leucemia mieloide acuta (LAM ): la maggior parte dei malati raggiunge la remissione in seguito a chemioterapia, ma, circa metà di questi, ricade. Inoltre, nonostante i miglioramenti nelle terapie di supporto, la morbidità e mortalità connesse al trattamento rimangono un problema importante. Lo scopo, dunque, della ricerca in campo LAM è quello di spiegare i meccanismi di leucemogenesi per scoprire nuovi oncogeni e target molecolari. Il fine di questi studi è quello di sviluppare nuove terapie farmaceutiche, diminuire la frequenza di ricaduta e ridurre gli effetti collaterali indotti dalle terapie correnti (1). Di recente, CREB (cAMP response element (CRE) binding protein) e’ stato dimostrato essere sovra espresso nell’84 % delle leucemie linfoblastiche acute e nel 66 % delle LAM, ma non in controlli sani ne in midolli di pazienti in remissione. CREB ad alti livelli si è visto essere associato ad una prognosi peggiore (2,3). In questa tesi è stato chiarito il meccanismo dell’overespressione e il ruolo di CREB nella leucemia mieloide pediatrica. In primo luogo è stato studiato ICER, il repressore endogeno di CREB. ICER è stato trovato sottoespresso in linee leucemiche mieloidi, e presenta un andamento inversamente proporzionale all’espressione di CREB. Durante questo dottorato, abbiamo indotto un’espressione forzata di ICER in cellule leucemiche in modo da abbassare la quantità di proteina CREB e col risultato maggiore di ridurre il potenziale clonogenico in vitro. In vivo, ICER ha ridotto l’invasione extramidollare e l’angiogenesi in topi NOD-SCID iniettati con una linea leucemica mieloide (HL60) stabilmente esprimente ICER, dimostrando dunque come quest’ultimo sia un soppressore della progressione tumorale anche in vivo. ICER reprime la maggior parte dei target di CREB andando a legarsi sul DNA agli stessi siti di interazione, la cosidetta sequenza CRE. L’assenza di ICER nella leucemia è stata inoltre dimostrata dipendere dalla degradazione della stessa proteina via proteasoma grazie alla documentata interazione con ERK (extracellular signal regulated protein kinase). ERK nella leucemia è upregolata e mantenuta attiva da CREB. Successivamente, il ruolo di ICER come fattore di trascrizione nel controllare i geni che sono coinvolti nel meccanismo di apoptosi e di proliferazione, ha dimostrato che i target repressi sono geni coinvolti soprattutto nel ciclo cellulare (CyA1, B1, D1) e nel pathway delle MAPK (ERK, AKT, DUSP1/4). Le fosfatasi DUSP1 e DUSP4 sono state identificate come i principali effettori dell’aumentata apoptosi indotta dopo somministrazione di chemioterapici, attraverso la mancata defosforilazione di P-p38, in quanto, un inibitore di p38 è stato in grado di invertire il fenomeno. Il silenziamento delle DUSP1/4 nella linea cellulare leucemica HL60 ha confermato gli stessi effetti dell’overespressione di ICER. Fenomeni analoghi si sono inoltre osservati nelle primarie di LAM. Succesivamente alla scoperta che l’overespressione della proteina CREB e il livello di mRNA non era diretta, abbiamo considerato che un meccanismo posttrascrizionale potesse essere una causa dell’overespressione di CREB nelle LAM (4). A questo scopo abbiamo considerato il possibile ruolo svolto da un miRNA su CREB. La caratterizzazione del miR-34b è giunta in primis dall’osservazone che questo fosse espresso in maniera ridotta nelle linee leucemiche e nei midolli di pazienti affetti da LAM, con andamento dunque inverso rispetto all’espressione della proteina CREB. Esperimenti in vitro hanno validato una regolazione diretta da parte del miR-34b su CREB. Il ripristino dell’espressione del miR-34b dunque è stato usato come tecnica per identificare il suo ruolo nelle LAM. Anomalie nel ciclo cellulare, una diminuizione del potere clonogenico e una alterazione dell’espressione dei geni target di CREB ha chiarito un ruolo come soppressore tumorale per il miR-34b. Il promotere del miR-34b/34c e’ stato poi scoperto essere ipermetilato nelle linee leucemiche, dando una spiegazione epigenetica alla ridotta espressione del miR-34b nelle LAM. In seguito, il meccanismo molecolare del miR-34b come soppressore tumorigenico è stato approfondito anche in campioni primari di midollo osseo provenienti da pazienti affetti da LAM. Colture primarie overesprimenti in maniera transiente il miR-34b hanno mostrato una diminuita clonogenicità e un aumento dell’apoptosi in vitro, mentre in vivo l’overespressione stabile del miR-34b in linee leucemiche iniettate in topi NOD-SCID ha rivelato una ridotta progressione del tumore. L’ipermetilazione del promotore del miR-34b, e la conseguente overespressione di CREB, è stata inoltre riscontrata nel 65,5 % (74/113) di pazienti all’esordio di LAM, ma in nessuno dei 49 pazienti affetti da sindrome mielodisplastica (MDS) o JMML (juvenile myelomonocitic leukemia) si è constatata metilazione. Anche i livelli di espressione di CREB in questo gruppo di pazienti non erano rilevabili. Interessante è stato trovare che tre pazienti con MDS evoluta a LAM acquisivano la metilazione solo alla diagnosi di leucemia conclamata. Il ruolo del miR-34b nell’evoluzione della LAM è stato quindi analizzato. Campioni di midollo osseo di donatore che presentano alti livelli di miR-34b e bassi livelli di CREB, sono stati usati come modello di evoluzione in LAM. Inibendo il miR-34b e aumentando l’espressione di CREB e dei suoi target ha alterato la mielopoiesi e la capacità clonogenica del campione sano. Riassumendo, questi risultati suggeriscono come CREB sia un proto-oncogene nelle LAM e ICER sia il suo soppressore. Inoltre, l’ipermetilazione del miR-34b che controlla l’espressione di CREB, si distingue come un processo critico nella patogenesi della leucemia mieloide acuta aprendo a futuri studi per lo sviluppo di nuove terapie terapeutiche mirate. BIBLIOGRAFIA 1. Rubnitz JE. Childhood acute myeloid leukemia. Curr Treat Options Oncol. 2008 Feb;9(1):95-105. Epub 2008 May 28. Review. PubMed PMID: 18506629. 2. Shankar DB, Cheng JC, Kinjo K, Federman N, Moore TB, Gill A, Rao NP, Landaw EM, Sakamoto KM. The role of CREB as a proto-oncogene in hematopoiesis and in acute myeloid leukemia.Cancer Cell. 2005 Apr;7(4):351-62. PubMed PMID: 15837624. 3. Pigazzi M, Ricotti E, Germano G, Faggian D, Aricò M, Basso G. cAMP response element binding protein (CREB) overexpression CREB has been described as critical for leukemia progression.Haematologica. 2007 Oct;92(10):1435-7. PubMed PMID: 18024382. 4. Wong A, Sakamoto KM. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor induces the transcriptional activation of egr-1 through a protein kinase A-independent signaling pathway. J Biol Chem. 1995 Dec 22;270(51):30271-3. PubMed PMID: 8530445.