Realizzazione multistep di neo-costrutti epatici con apporto vascolare attraverso tecniche di tissue engineering

INTRODUCTION: This multistep work has investigated tissue engineering of the liver as approach for treating end-stage liver diseases by different projects. Engineering of hepatic tissue based on primary hepatocytes offers new perspectives in this field. However, generation of thick, 3D liver tissue has been limited by the lack of vasculature in the engineered constructs; hepatocyte survival is transient if limited by insufficient vascular-network formation. To overcome this limitation and establish a vascularized construct, we firstly worked on designing a novel microfluidic-based bilayer device with a discrete parenchymal chamber modeled upon hepatic organ architecture. The design enables the device concept to serve as both a platform technology for drug discovery and toxicity, and for the continuing development of an improved liver-assist device. Thereafter the designed device has been moved to an in vivo animal model (project 2), evaluating the liver-assist device platform with a microfluidic-modeled vascular network in a femoral arteriovenous shunt model in rats. On this basis, we proceeded with efficiently differentiating precursor liver cells into mature cells within 3D bioreactor systems in different culture conditions. Combined and distinct methods have been tested to enhance the in vitro differentiation of liver precursor cells (project 3). Finally, new smart 3D scaffolds cultured with a mixed population of hepatocytes and mesenchymal stem cells have been implanted in vivo (project 4), after adequate preconditioning in the previous bioreactor system, to induce angiogenesis processes. These different approaches can be efficiently put together for the final realization of an in vivo bio-artificial liver construct. METHODS: Project 1: 18 assembled devices with continuous flow have been tested for the capability of transporting of metabolites and small proteins while protecting an adjacent cell culture from the effects of shear stress. Devices were seeded with HepG2/C3A and primary hepatocytes in different culture conditions to test the final capability of the system to maintain an efficient dynamic culture. Project 2: 16 devices (assembled in project 1) with rat primary hepatocytes and 12 with human HepG2/C3A cells were tested in athymic rats in a femoral arteriovenous shunt model. Several parenchymal tube configurations were evaluated for pressure profile and cell survival. The blood flow pattern and perfusion status of the devices was examined by laser Doppler scanning. Cell viability and serum protein secretion functions were assessed. Project 3: Pluripotent Human Liver Stem Cells (HLSCs) were seeded onto 18 3D "smart scaffolds" composed by a biocompatible collagen-sponge. The scaffold was connected to a novel perfusion bioreactor able to ensure long-term uniform flow of medium through the material sponges; stem cells medium and co-culture with hepatic stellate cells (HSCs) were added in different conditions. Tissue engineering strategies based on the co-cultivation of HLSCs with hepatic stellate cells (ITO) and with several combinations of medium were applied. Morphological and functional assays were performed at day 3, 5 and 7 of the in vitro perfusion condition Project 4: 12 scaffolds composed by 3D hyaluronan-derivative [a benzyl ester of hyaluronan (HYAFF®), seeded with a population of human mesenchymal stem cells (HMSCs) and hepatocytes in different ratio, were firstly cultured in the previous bioreactor system to induce a preconditioning stimulus for proliferation and regeneration. The scaffolds were then implanted onto the omentum of 12 nude rats and then rolled into a 3-D pocket structure. Morphological assays were performed to test the neoangiogenesis properties of HMSCs and establish hepatocytes viability after 7 days. RESULTS: Project 1: The assembled device was able to sustain both human hepatoma cells and primary rat hepatocytes by continuous in vitro perfusion of medium, allowing proliferation and maintaining hepatic functions such as serum protein synthesis and metabolism. The mathematical model estimated the best flow rate for perfused cultures lasting up to 14 days. Project 2: The testing in femoral arteriovenous shunt model was successfully established in all animals. Blood flow was homogeneous through the vascular bed and replicated native flow patterns. Survival of seeded liver cells was highly dependent on parenchymal chamber pressures. The tube configuration that generated the lowest pressure supported excellent cell survival and function. Project 3: The hepatic differentiation of HLSCs from adult liver has been improved in 3D collagen scaffolds, confirmed by morphological and functional assays; the flow of perfusion medium (assured by the bioreactor system) enabled the in vitro organization of the cells into liver clusters even in the deeper levels of the sponge. This preliminary experiment has shown that collagen sponge and dynamic in vitro condition not only promote formation of cellular bodies of HLSCs but also enhance a more rapidly functional differentiation into a mature hepatic population. Project 4: The final ongoing project moved to the in vivo model. After a preconditioning period in the bioreactor assembled in project 3, cultured HYAFF®) 3D scaffold (with hepatocytes plus HMSCs or hepatocytes alone) have been implanted in rats. New tissues consisting of neo-angiogenesis’ clusters organized in vessel-like structures formed by 1 week, and the hepatocyte mass survived during all the study-time. Vascular structures, identified by H&E staining, were positive for von Willebrand factor. Hepatocytes were immunohistochemically positive for albumin and CK8-18-19. These results suggest that our “bio-engineered-reactor” is characterized by a steady neovasculature potentiality and keeps capacity for supporting hepatocyte viability. CONCLUSIONS: A preliminary multistep approach to generate in vivo morphologically and functionally complex new tissue has being constituted from simple monolayer. This ongoing work represents a preliminary step toward the final engineer of liver-organoid vascularized construct.

INTRODUZIONE: Il progetto oggetto di questa tesi si è proposto di applicare le tecniche di ingegneria tissutale come approccio alla realizzazione di costrutti epatici per il supporto metabolico delle malattie del fegato; la realizzazione del lavoro si è sviluppata attraverso la successione multistep di diversi progetti tra loro complementari. L’ingegnerizzazione di tessuto epatico attraverso colture di epatociti primari infatti offre nuove prospettive in questo ambito; tuttavia la realizzazione di strutture 3D è spesso limitata dalla mancanza di una struttura vascolare in grado di costituire un adeguato supporto nutritivo. D’altra parte gli epatociti sono cellule ad alto metabolismo e la loro sopravvivenza è limitata in condizioni ipossiche, in mancanza di una sufficiente rete vascolare. Al fine di superare questo problema e di ottimizzare le condizioni per il supporto di nutrienti, abbiamo innanzi tutto rivolto l’attenzione alla realizzazione di un bioreattore bilayer, sviluppato nelle 2 dimensioni, e ingegnerizzato partendo da dati noti di microfluidodinamica; inoltre in grado di proporre un sistema di coltura basato sulla anatomia microscopica del fegato. Tale design ha permesso la realizzazione di un bioreattore in grado di costituire una piattaforma da utilizzare come unità di drugtesting, ma anche per la successiva realizzazione di un sistema di assistenza epatica (progetto 1). Sulla base dei dati ottenuti, il progetto è stato in seguito traslato nel modello in vivo e il bioreattore è stato testato nel piccolo animale; l’impianto del device è stato realizzato ex vivo mediante il confezionamento di uno shunt artero-venoso femoro-femorale (progetto 2). Il lavoro è stato quindi implementato sviluppando sistemi di coltura nelle 3 dimensioni (progetto 3); diverse combinazioni di coltura su scaffolds 3D in perfusione continua, all’interno di nuovi bioreattori, sono state testate per l’induzione differenziativa di cellule staminali (precursori epatocitari di origine umana). I successi ottenuti hanno spinto alla realizzazione dell’ultimo step (progetto 4). Smart scaffolds 3D di nuova generazione sono stati utilizzati per allestire colture 3D attraverso diverse combinazioni di popolazioni cellulari (epatociti primari + cellule mesenchimali staminali o soli epatociti primari), inducendo processi di neoangiogenesi. Dopo adeguato preconditioning in bioreattori in vitro, lo scaffold è stato in seguito impiantato in vivo, nel piccolo animale. METODI: Progetto 1: 18 bioreattori ingegnerizzati a flusso continuo sono stati testati per la loro capacità di trasporto di metaboliti all’interno di un compartimento parenchimale ove le colture cellulari sono state protette dagli effetti nocivi di shear stress. I bioreattori sono stati sottoposti a semina con cellule HepG2/C3A ed epatociti primari in diverse condizioni di coltura, al fine di testare la capacità del sistema di mantenere in vitro una coltura dinamica, vitale ed efficiente dal punto di vista metabolico. Progetto 2: 16 bioreattori (precedentemente ingegnerizzati nel progetto 1) sono stati utilizzati e sottoposti a coltura con epatociti primari e 12 con cellule umane HepG2/C3A; i bioreattori sono stati impiantati ex vivo in ratti atimici attraverso la realizzazione di uno shunt artero-venoso femoro-femorale. Il setting del bioreattore exvivo ha previsto diverse configurazioni, testate sotto il profilo dei parametri di vitalità cellulare sulla base dei relativi dati di pressione e di flusso nelle diverse configurazioni. Il pattern di flusso ematico e la perfusione del sistema sono stati esaminati attraverso laser Doppler scanning. La vitalità cellulare e la funzionalità metabolica sono state inoltre verificate. Progetto 3: una popolazione di Pluripotent Human Liver Stem Cells (HLSCs) è stata coltivata su 18 "smart scaffolds" 3D, composti da spugne di collagene biocompatibile. Lo scaffold è stato inserito in un nuovo bioreattore per la perfusione di strutture 3D in grado di garantire flussi uniformi di medium; medium per cellule staminali e colture miste con cellule stellate del fegato (HSCs) sono state aggiunte in diverse condizioni di coltura. Le diverse combinazioni sono state testate attraverso l’esecuzione di studi morfologici e funzionali rispettivamente nei giorni 3, 5 e 7 della perfusione in vitro. Project 4: 12 scaffolds 3D, costituiti da un derivato dell’acido ialuronico [a benzyl ester of hyaluronan (HYAFF®) sono stati sottoposti a semina con popolazioni di cellule staminali mesenchimali di origine umana (HMSCs) ed epatociti in diverse combinazioni; è stata allestita una coltura in perfusione continua nel bioreattore precedentemente descritto (preconditioning). In seguito gli scaffolds sono stati impiantati nell’omento di 12 ratti atimici, costituendo una tasca “rolled” 3D. Studi morfologici sono stati eseguiti al fine di valutare i processi di neoangiogenesis sostenuti dalle cellule HMSCs e valutare la vitalità epatocitarie a 7 giorni dall’impianto. RISULTATI: Progetto 1: Il bioreattore ingegnerizzato si è dimostrato in grado di sostenere entrambe le popolazioni cellulari in studio, comprese colture primarie di epatociti (notoriamente più sensibili), attraverso la realizzazione di una perfusione continua di medium sovrapponibile a flussi fisiologici. Tale circostanza ha favorito sia i processi di proliferazione cellulare che la funzione metabolica epatocitaria (sintesi proteica). Il modello matematico del sistema ha permesso di sostenere una coltura dinamica fino a 14 giorni. Progetto 2: Il bioreattore, collegato all’animale attraverso il confezionamento di uno shunt femorale artero-venoso, ha realizzato un sistema di perfusione ex vivo. Il flusso ematico all’interno del network vascolare si è dimostrato omogeneo nel tempo ed ha ricostituito il fisiologico pattern di flusso artero-venoso del fegato. La sopravvivenza cellulare ha dimostrato alti valori dipendentemente dai valori pressori raggiunti all’interno della camera parenchimale. La configurazione del sistema che ha generato la minore pressione all’interno della camera parenchimale ha dimostrato anche i migliori risultati in termini di sopravvivenza cellulare. Progetto 3: con l’intenzione di costituire strutture 3D, la differenziazione epatica di cellule HLSCs da fegato umano è stata indotta in scaffolds di collagene; i test morfologici e gli assays funzionali hanno confermato la maturazione. Il flusso continuo di perfusione del medium (garantito dal bioreattore) ha favorito in vitro la distribuzione delle cellule in clusters organizzati fino alle porzioni più profonde dello scaffold. Gli esperimenti hanno dimostrato che la spugna di collagene e le condizioni di coltura dinamica in vitro sono in grado di promuovere non solo la formazione di aggregati di HLSCs ma anche di favorire una più rapida maturazione verso fenotipi epatici maturi. Progetto 4: lo step finale, ancora in corso, ha previsto l’induzione della neoangiogenesi in vivo. Dopo un processo di preconditioning della coltura cellulare nel bioreattore precedentemente ingegnerizzato (progetto 3), scaffolds 3D di HYAFF® con combinazioni diverse di epatociti primari e MSCs, sono stati impiantati nei ratti. Il costrutto cosi ottenuto a 7 giorni dall’impianto ha dimostrato, alla immunofluorescenza, la formazione di iniziali clusters in cui si sono identificati eventi neoangiogenetici con formazione di strutture simil-vascolari. Gli epatociti sono sopravissuti durante tutto il periodo di studio; positiva la ricerca, alla immunofluorescenza, per albumina, CK8-18- 19. Le strutture vascolari, identificate dapprima con colorazione EE, si sono dimostrate positive alla immunofluorescenza per il fattore di von Willebrand. I dati sono suggestivi per ulteriori studi nell’ambito dei processi di neoangiogenesi. CONCLUSIONI: Gli approcci preliminari ci hanno permesso di raggiungere e ottenere in vivo risultati promettenti nella ricostituzione di costrutti epatici caratterizzati da processi neoangiogenetici, partendo da semplici layers 2D. I risultati sono suggestivi per sviluppi futuri di ingegnerizzazione di organoidi epatici.