Interazione tra proteine virali e cellulari coinvolte nelle fasi tardive del ciclo replicativo del virus dell'immunodeficienza felina

Feline Immunodeficiency Virus (FIV) is a non-primate lentivirus that causes an immunodeficiency syndrome in domestic cats, that is striking similar to AIDS in humans. FIV is similar to Human Immunodeficiency Virus type 1 (HIV-1) in many molecular and biochemical properties, thus representing an attractive model for AIDS research in many different aspects ranging from pathogenesis to therapeutic approaches. In this context, understanding the interplay between viral and host factors plays a crucial role in the efforts for elucidating the molecular mechanisms involved in virus pathogenicity and thus for the development of effective therapeutic and vaccine approaches. In order to fully take advantages of these important properties and considering that the present understanding of FIV biology lags behind knowledge accumulated on HIV, different aspects of FIV life cycle need to be further investigated. In particular, we focused our attention on viral budding. As for all the other retroviruses, FIV Gag can assemble and lead to Virus Like Particles (VLPs) budding from cells in the absence of other proteins / viral determinants. To accomplish this, RNA-enveloped viruses bud from infected cells by exploiting the Multivesicular Body (MVB) pathway. In this context, ubiquitination of structural viral proteins and their direct interaction with cellular factors involved in the MVB biogenesis through short proline rich regions, named Late domains (L domains), are crucial mechanisms. The overall goal of the study is to characterize the late steps of FIV replication. In particular, our attention has been focused on i) dissecting viral/cellular protein interactions involved in budding and ii) the identification of the host factors that can interfere in this process. Firstly, we focused our attention on the role of the major structural FIV Gag protein in viral budding and the pathways that FIV exploits for its budding. Here we report that, in contrast with HIV-1, FIV is strictly dependent for its budding on a ‘‘PSAP’’-type L-domain, mapping in the carboxy-terminal region of Gag, irrespective of a functional viral protease. Moreover, we demonstrate that FIV egress is related to Gag ubiquitination, that is linked to the presence of an active L-domain. We demonstrate that FIV, thanks to its L domain, hijacks the MVB biogenesis machinery to execute its efficient exit from cells. In order to further characterize the contribution of the entire p2 region in FIV egress and the role of cellular proteins in the process, we noticed that a p2 mutant characterized by the complete disrupting of the PSAP late domain could be rescued by the over-expression of the cellular protein AIP1/Alix. Interestingly we were able to identify in p2, down-stream the PSAP sequence, an LLDL motif, which is reminiscent of the YPXnL L-domain. It is well known that in EIAV, a sequence “YPDL”, mapping at the level of Gag p9, is essential for viral budding through the interaction with AIP1/Alix. In particular, we demonstrated that the complete destruction of LLDL motif, in the context of PSAP late domain intact, has no impact in the release of FIV. Next, we analyzed whether the LLDL motif may function as an auxiliary L-domain in the context of FIV-Gag, and, specifically, mimicking the YPXnL type of L-domains. We were able to show that, also under these conditions, AIP1/Alix is still capable of rescuing VLPs production and any p2 sequences are strictly necessary for its incorporation in FIV VLPs. The data obtained indicate that the LLDL motif does not represent an auxiliary late domain for FIV. In the context of HIV-1, it has recently been proposed that the nucleocapsid domain (NC) cooperates with p6 in recruitment of cellular proteins required for viral budding and, in particular, it has been shown that the zinc finger present in NC represent additional binding sites for AIP1/Alix. To investigate this aspect in FIV, we analyzed the contribution of the NC domain in the cooperation with the late domain in the budding and its possible interaction with AIP1/Alix. Thus, we mutagenized FIV zinc finger motifs and, in particular, we generated different NC mutants in combination with alterations at the level of the carboxyterminal region of Gag. In contrast to what occours in HIV-1, we demonstrated the absence of involvement of FIV NC in the budding rescue ability of AIP1/Alix. In the second part of the research, we analyzed some molecular aspects underlying the specie-specificity of the late step of FIV replication. Recently it has been reported that the human cellular protein tetherin (or hBST2) is able to block the release of HIV-1 viral particles from infected cells and that HIV-1 has evolved specific countermeasures to antagonize its effects. Starting from these findings, by means of a detailed bioinformatics analysis in the feline genome, it was possible to identify the ortholog of the human protein BST2/tetherin, renamed cBST2 or feline tetherin. We were able to show that cBST2 is unable to interfere with FIV release, since its effect is antagonized by a combined action of the structural Env protein and the accessory Orf-A protein. Furthermore, in agreement with the specie-specificity of these antiviral factors, we demonstrated that the feline tetherin is able to prevent the particle release of HIV-1, a human primates lentivirus, and that human tetherin blocks the particle release of FIV, a lentivirus which infects the non human primates. In conclusion our data bring to light peculiar aspects of FIV biology and, in particular, put the basis for the identification of cellular mechanisms either shared or highly divergent between FIV and HIV-1, with profound implication for the use of FIV as model for studying HIV pathogenesis and therapy.

Il Virus dell'Immunodeficienza Felina (FIV) è un lentivirus che infetta i non primati e causa una sindrome da immunodeficienza nel suo ospite, il gatto domestico, simile all'AIDS nell'uomo. FIV presenta numerose omologie molecolari e patogenetiche con il Virus dell’Immunodeficienza Umana di tipo 1 (HIV-1), rappresentando quindi un ottimo modello per lo studio di HIV-1 e per lo sviluppo di vaccini e di vettori per la terapia genica. In questo contesto, la caratterizzazione dei determinanti virali e cellulari, che regolano il rilascio delle particelle dalle cellule infettate, riveste un ruolo cruciale non solo dal punto di vista dello studio della biologia del virus, ma anche per l'identificazione di nuovi target terapeutici e per lo sviluppo di vettori lentivirali basati su FIV, da impiegare per l’espressione ed il trasferimento di transgeni in cellule eucariotiche. In particolare, la nostra attenzione si è focalizzata sulla fase di gemmazione. La sola poliproteina strutturale Gag di FIV, così come quella degli altri retrovirus, è in grado di assemblarsi e mediare il rilascio di particelle simil-virali (Virus-like particles, VLPs) in assenza di altre proteine/determinanti virali. A tal fine, questi virus ad RNA dotati di envelope gemmano dalle cellule infettate, sfruttando il pathway dei Multivesicular Bodies (MVB), attraverso l’ubiquitinazione delle proteine strutturali e/o la loro diretta interazione con proteine cellulari, le quali sono coinvolte nella biogenesi di questi organelli, mediante corti motivi aminoacidici ricchi in prolina, noti come domini tardivi (Late domain o L domain). Il presente lavoro di dottorato si è proposto di caratterizzare le fasi tardive del ciclo replicativo di FIV. L’attenzione è stata focalizzata sullo studio i) delle interazioni tra proteine cellulari e virali coinvolte nella gemmazione e ii) dei fattori dell’ospite in grado di interferire a livello di tale processo. Nella prima parte della ricerca è stato caratterizzato il contributo della poliproteina Gag nel rilascio delle particelle virali e il pathway cellulare impiegato da FIV durante la gemmazione. E’ stato possibile dimostrare come FIV sia strettamente dipendente dal dominio tardivo PSAP, contenuto nella regione carbossiterminale p2 di Gag, per il rilascio delle particelle virali, a prescindere dalla presenza di una proteasi virale attiva. E’ stato inoltre documentato come il suddetto dominio tardivo permetta a FIV di sfruttare il pathway dei MVB per gemmare in modo efficiente dalle cellule e come questo sia correlato all'ubiquitinazione di Gag, possibile solo in presenza del dominio tardivo attivo. Nel tentativo di caratterizzare ulteriormente il ruolo dell'intera regione p2 nella gemmazione, è stato osservato che la capacità di produrre VLPs da parte del mutante con il dominio tardivo PSAP inattivato poteva essere ripristinata over-esprimendo nelle stesse cellule la proteina cellulare AIP1/Alix. Significativamente, analizzando la regione p2 è stato possibile identificare un motivo LLDL a valle di PSAP, reminiscente del late domain YPDL, che in EIAV risulta essere essenziale per la gemmazione virale in quanto interagisce con la proteina cellulare AIP1/Alix. E’ stata quindi verificata la possibilità che tale motivo avesse funzione di dominio tardivo in FIV. In particolare, è stato dimostrato come la completa distruzione del motivo LLDL, nel contesto del dominio tardivo PSAP intatto, non abbia alcuna funzione nella gemmazione del virus. E’ stata quindi vagliata la possibilità che il motivo LLDL potesse funzionare da late domain ausiliario coinvolgendo, in alcuni casi, la proteina AIP1/Alix. Si è quindi proceduto ad analizzare la capacità di AIP1/Alix di ripristinare il rilascio di VLP di mutanti a livello del dominio p2 di Gag. E’ stato dimostrato come la over-espressione di AIP1/Alix sia in grado di ristabilire la gemmazione dei mutanti difettivi a livello del dominio tardivo e di come tale proteina sia incorporata nelle stesse VLPs, in assenza di un’interazione con il motivo LLDL. I dati ottenuti indicano come il motivo LLDL non rappresenti per FIV un dominio tardivo ausiliario. Nel contesto di HIV-1, di recente è stato proposto che il dominio nucleocapside (NC) cooperi con p6 nel reclutamento delle proteine cellulari richieste per la gemmazione virale ed, in particolare, è stato dimostrato come gli zinc finger presenti a livello di NC rappresentino addizionali siti di legame per la proteina AIP1/Alix. Alla luce di queste evidenze sperimentali, è stato quindi analizzato il contributo del NC di FIV nella cooperazione con i domini tardivi nella gemmazione e la sua possibile interazione con AIP1/Alix. A tale scopo, sono stati generati dei costrutti FIV-derivati recanti specifiche mutazioni a livello di NC in combinazione con alterazioni nella regione carbossiterminale. Diversamente da quanto accade in HIV-1, è stata dimostrata l’assenza di coinvolgimento del nucleocapside di FIV nel ripristino della gemmazione di tali mutanti del late domain, in presenza di sovraespressione di AIP1/Alix. Nella seconda parte della ricerca, sono stati analizzati alcuni aspetti molecolari alla base della specie-specificità degli eventi tardivi della replicazione di FIV. Recentemente in letteratura è stato riportato come la proteina cellulare umana teterina (o hBST2) sia in grado di interferire con il rilascio delle particelle virali di HIV-1 dalle cellule infettate e come tale virus abbia evoluto specifiche contromisure per antagonizzarne l’effetto. Sulle basi di tali studi, in seguito ad una profonda analisi bioinformatica nel genoma felino, è stato possibile identificare l’ortologo della proteina umana BST-2/teterina, rinominato cBST2 o teterina felina, e ne è stata valutata la funzionalità. I risultati indicano come cBST2 non sia in grado di interferire con il rilascio di FIV, in quanto il suo effetto è antagonizzato dall’azione combinata dalla proteina strutturale Env e della proteina accessoria Orf-A. Inoltre, in accordo con la specie-specificità di questi fattori antivirali, è stato dimostrato come la forma felina di BST2 sia in grado di impedire il rilascio delle particelle virali di HIV-1, lentivirus che infetta i primati umani, e come teterina umana, invece, blocchi la gemmazione di FIV, lentivirus che infetta i non primati. I risultati ottenuti permettono di approfondire le conoscenze legate alla biologia di FIV, in particolare quelle relative ai meccanismi cellulari, condivisi oppure altamente divergenti, con il ciclo biologico di HIV-1 e possiedono profonde implicazioni nell'uso di FIV come modello per l’AIDS e nelle applicazioni in ambito biotecnologico e veterinario.