Development of derivatives of natural polyphenols for pharmacological applications

The research project I have been engaged in during my graduate studies is meant to open the way to the pharmacological exploitation of plant polyphenols, a vast family of natural compounds present in many foods and drinks. Its marked interdisciplinary characteristics have allowed me to expand my scientific interests while at the same time finalizing my synthesis work for well-defined goals. The biomedical effects of plant polyphenols are of great interest and have been stimulating much research, conducted largely in vitro, using model systems such as cell cultures. These studies show that many polyphenols can stimulate or interfere with biochemical processes, and that several of them may find useful applications in the therapy and/or prevention of diseases and conditions of great medical interest. For example some polyphenols are reported to prevent the onset and to inhibit the growth of several types of cancer, to protect the cardiovascular system and to slow down senescence and the course of neurodegenerative diseases. Applications such as these are however severely hindered by the low bioavailability of these compounds. As a result of a low level of absorption and of a rapid metabolism/degradation in the intestinal and hepatic compartments, only small amounts of polyphenols are found in the bloodstream, and then mostly as metabolites. We have identified two possible strategies to increase the effectiveness of polyphenols. One is to concentrate them in the organs and/or subcellular compartments in which their properties can have a major impact. This approach, embodied in mitochondrial targeting, has led to six scientific papers, already published (Chapt.s 1-4) or submitted for publication (Chapt.s 5-6), which form the first part of the thesis. A second strategy to reduce the obstacle of low bioavailability involves the production of new derivatives (prodrugs) that can act as vehicles of polyphenols, being more resistant to metabolism during the absorption and capable of regenerating the natural compound once the barrier of first-pass metabolism has been overcome. The results of these efforts are described in two papers and are reported in Chapters 7-8. Finally, during a 6-months stage at the University of Illinois in Chicago I carried out the synthesis of new derivatives of daidzein, a major natural soy isoflavone, which incorporate a histone deacetylase (HDAC)-inhibitory functionality (Chapter 9). These new compounds are presently being tested at Burke/Cornell Medical Research Institute to assess possible effects on the expression of Arginase 1. A brief description of the major results presented in the thesis follows, and the major new compounds produced are presented at the end of this section. Mitochondriotropic derivatives. Polyphenols are redox-active molecules, and can thus intervene in oxidative processes involved in several pathologies. Mitochondria are the major source of reactive oxygen species (ROS) production and the site of key events for cell death in both the apoptotic and necrotic modes, processes in which ROS play a key role. This part of the project originated from the observation that quercetin (3,3’,4’,5,7-pentahydroxyflavone) can either inhibit or induce the mitochondrial permeability transition, depending on whether its anti- or pro-oxidant activity prevails. This depends on a series of factors including the presence of metal ions with easily interconverting oxidation states, and/or enzymes with redox activity, the pH, and the concentration of the polyphenol itself. I have synthesized some mitochondriotropic derivatives of model polyphenols quercetin and resveratrol (3,4’,5-trihydroxy-trans-stilbene), both common and much studied natural compounds with interesting properties. The synthesized derivatives are mitochondriotropic thanks to functionalization with the triphenylphosphonium (TPP+) group, a cation capable of diffusing through biological membranes and of concentrating in regions at negative electrical potential, such as the mitochondrial matrix. Quercetin has five non-equivalent hydroxyls. For these syntheses it has been therefore important to develop approches that would insure regioselectivity with relative simplicity and high yields. The general strategy for the synthesis of quercetin derivatives has thus involved the selective protection/deprotection of hydroxyls (Chapters 1 and 3). These compounds exhibited the expected mitochondriotropic behaviour in in vitro assays involving isolated mitochondria and cultured cells (Chapters 1 and 2). Since they are polyphenols, a priori these compounds may display an anti-oxidant/cytoprotective action or, on the contrary, a pro-oxidant/cytotoxic behaviour. Interesting possible biomedical applications can be envisioned in either case. A first investigation on the biological effects of these new compounds has been carried out with isolated mitochondria, using two quercetin derivatives modified at position 3, namely 3-O-(triphenylphosphoniumbutyl) quercetin iodide (3-QBTPI), and its peracetylated analogue (3-QTABTPI). As expected on the basis of previous observations with quercetin, these compounds turned out to be potential co-inducers of the mitochondrial permeability transition, and inhibitors of the mitochondrial ATP synthase (Chapter 4). To verify the relevance of the position occupied by the TPP-carrying substituent on the quercetin skeleton I also synthesized the mitochondriotropic analogues of 3-QBTPI and 3-QTABTPI with the phosphonium ion linked to position 7 (7-QBTI and 7-QTABTPI) (Chapter 3). We have then characterized the redox behaviour of the two mitochondriotropic isomers, 3- and 7-O-(4-triphenylphosphoniumbutyl) quercetin iodide. In both cyclic voltammetric determinations of the oxidation potential and in radical scavenging assays with 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) the 7-substituted isomer behaved much like quercetin itself, while the 3-substituted isomer was more difficult to oxidize at the electrode and much less reactive towards DPPH. Moreover, the 7-substituted isomer proved to be more active (cytotoxic) in cell vitality assays, and thus emerges as the isomer of choice for further studies (Chapter 5). The mitochondriotropic quercetin derivatives cause necrotic cell death and act as prooxidants, inducing generation of superoxide anion in the mitochondria. The generation of superoxide is what causes cell death. Necrosis induction is selective, hitting faster-growing C-26 tumoral cells and Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) and sparing slower-growing MEFs. Measurements of mitochondrial content and superoxide production suggest that the selectivity of the cytotoxic effect might be related to the concentration of mitochondrial superoxide attained. (Chapter 6). Prodrugs of polyphenols. Interest in these derivatives originated from the idea of using common reactions in organic synthesis to produce derivatives of resveratrol (used as a model polyphenol in this study) bearing protecting groups on the hydroxyls. The purpose of these protections is to slow down or eliminate metabolic processes during the absorption phase, thus resulting in higher systemic levels of polyphenol following the removal of protective groups by hydrolysis promoted by ubiquitous enzymes. Our first choice was to protect the phenol hydroxyl moieties using the carboxyester bond and several derivatives of resveratrol were synthesized (Chapter 7). However, the results of stability studies in blood, of absorption experiments using ex vivo intestine segments mounted in Ussing chambers and of in vivo (rat) pharmacokinetic determinations have pointed out an excessive instability of the carboxyester linkage in these biological contexts. Its usefulness for in vivo applications turns out therefore to be limited. Other types of protecting linkages were thus considered, which are expected to be less susceptible to hydrolysis than the carboxyesters. The first alternative protecting bond tested was the methanesulfonate ester (–O(SO2)CH3) (resveratrol trimesylate) (Chapter 7). This compound proved to be stable in vitro, while the carboxyester derivatives are slowly hydrolysed in solutions at pH values mimicking the gastric or intestinal environment and are rapidly converted to resveratrol in blood. In ex vivo permeation experiments with explanted intestinal segments, resveratrol and carboxyester derivatives appeared in the basolateral compartment essentially as a mixture of Phase II metabolites. On the other hand, the trimesylate precursor was transported from the apical to the basolateral side without hydrolytic or metabolic modifications. Pharmacokinetic determinations also indicated that this type of bond is too stable and not susceptible to enzymatic hydrolysis thus preventing the regeneration of the active deprotected form of the polyphenol. An analogous conclusion was reached for ether derivatives. Polyphenols generally have low solubilities in water, and solubility is a key factor contributing to the bioavailability of a compound and allowing convenient means of administration. We therefore synthesized a first soluble resveratrol derivative (RGS) linking the hydroxyls to glucose moieties via a succinic acid group (Chapt. 8). Pharmacokinetic studies with this compound showed that absorption kinetics are delayed in comparison to resveratrol, a potentially useful outcome. The levels and the composition of the metabolite mix in the bloodstream are however analogous to those obtained using resveratrol itself. This suggests that the compound is hydrolysed to resveratrol in the gastro-intestinal tract, before absorption, due to the poor stability of the carboxyester linkage (Chapter 8). Derivatives of daidzein. During the third year of my graduate studies I also carried out a project over six months (March-August 2010) spent in the group of Prof. Alan Kozikowski at the University of Illinois at Chicago (UIC). During this period I performed the synthesis of a few new derivatives of daidzein, a major polyphenol belonging to the family of soy isoflavones (Chapter 9). Daidzein potentiates the expression of arginase 1 (Arg 1), a key enzyme in the biosynthesis of polyamines, which have a protective role in the central nervous system and favour neurite regeneration after a trauma. This isoflavone is furthermore a well-known agonist of the β estrogen receptor, and can also act as an inhibitor of histone deacetylases (HDACs), enzymes involved in the control of gene expression. I have therefore worked to combine in a single molecule these various properties, producing derivatives capable of inducing Arg1 expression while maintaining the ability to interact with the estrogen receptor, and endowed with a higher affinity for HDACs. To achieve this enhancement of inhibitory effectiveness I attached the hydroxamic acid moiety to the daidzein skeleton, using chemical tools such as Michael addition on protected daidzein and so-called “click chemistry”. The retention of the isoflavone structure and the free hydroxyls in our products should ensure the retention of the estrogenic activity. In five synthetic steps I have obtained four stereoisomeric products, whose pharmacology is still under investigation.

Il progetto di ricerca trattato in questa tesi di dottorato intende contribuire allo sfruttamento farmacologico dei polifenoli vegetali, una vasta famiglia di composti naturali presenti in molti cibi e bevande. Si tratta di un progetto marcatamente interdisciplinare, caratteristica che mi ha permesso di allargare il mio orizzonte culturale e allo stesso tempo di finalizzare il lavoro di sintesi a obiettivi ben definiti. Gli effetti biomedici dei polifenoli vegetali sono oggetto di grande interesse e di molta ricerca, condotta in gran parte in vitro, usando sistemi modello come colture cellulari. Questi studi dimostrano che molti polifenoli possono stimolare o interferire con processi biochimici e che alcuni di essi potrebbero trovare utili applicazioni nella terapia e/o prevenzione di alcune patologie di grande interesse medico, ad esempio per prevenire l’insorgenza e inibire la crescita di molti tipi di cancro, per proteggere il sistema cardiovascolare o ancora per rallentare l’invecchiamento e il decorso di patologie neurodegenerative. Queste potenzialità trovano però un grosso ostacolo nella loro esplicazione a causa della scarsa biodisponibilità di questi composti. Come risultato del loro scarso assorbimento e della cospicua metabolizzazione a livello intestinale ed epatico, infatti, solo piccole quantità di polifenoli entrano nel circolo sanguigno, e per lo più sotto forma di metaboliti. Abbiamo individuato due possibili strategie per aumentare l’efficacia dei polifenoli. Una è di farli concentrare negli organi e/o nei comparti subcellulari in cui le loro proprietà possono avere il massimo impatto. Questo approccio, concretizzato nel targeting mitocondriale, ha portato alla realizzazione di sei lavori, ad oggi già pubblicati (Cap. 1-4), o inviati per la pubblicazione (Cap. 5-6), che costituiscono i primi sei capitoli della tesi. Una seconda strategia per superare il problema della bassa biodisponibilità prevede la realizzazione di nuovi derivati che possano funzionare da veicoli di polifenoli (pro-drugs) resistenti alla metabolizzazione durante l’assorbimento e in grado di rigenerare il composto naturale una volta superata la barriera della metabolizzazione di primo passaggio. I risultati di questi studi sono descritti in due lavori a stampa che costituiscono i capitoli 7-8. Infine, durante uno stage di sei mesi all’Università dell’Illinois, a Chicago, ho effettuato la sintesi di alcuni nuovi derivati della daidzeina, un importante isoflavone della soia, che incorporano la funzionalità per l’inibizione dell’istone deacetilasi, una classe di enzimi coinvolta nell’espressione genica (Capitolo 9). Questi nuovi composti sono tuttora in corso di investigazione biologica al Burke/Cornell Medical Research Institute per verificare un possibile effetto nell’induzione dell’espressione di Arginasi 1. Segue una breve descrizione dei più importanti risultati presentati nella tesi, mentre i principali nuovi composti sintetizzati sono presentati alla fine di questa sezione. Derivati mitocondriotropici. I polifenoli sono molecole redox-attive e possono quindi intervenire nei processi radicalici che sono coinvolti in molte patologie. Il sito principale di produzione dei radicali sono i mitocondri, sede di eventi chiave nella morte cellulare sia per apoptosi che per necrosi, processi in cui hanno un ruolo determinante le specie reattive dell’ossigeno. Importante per la genesi di questa ricerca è stata l’osservazione che la quercetina (3,3’,4’,5,7-pentaidrossiflavone) è in grado di inibire o indurre l’apertura del poro di transizione di permeabilità mitocondriale, a seconda che prevalga la sua attività anti- o pro-ossidante. Questo dipende da diversi fattori, tra cui l’azione di ioni metallici e di enzimi redox, il pH e la concentrazione del polifenolo stesso. Ho sintetizzato alcuni nuovi derivati mitocondriotropici di quercetina e resveratrolo (3,4’,5-triidrossi-t-stilbene), due polifenoli naturali molto diffusi e molto studiati in quanto dotati di interessanti proprietà. Questi composti sono resi mitocondriotropici grazie alla funzionalizzazione con un gruppo trifenilfosfonio (TPP+), un catione in grado di diffondere attraverso le membrane biologiche e di accumularsi in regioni a potenziale negativo, quali la matrice mitocondriale. La quercetina possiede 5 ossidrili di cui nessuno è equivalente ad un altro. Per queste sintesi è stato quindi rilevante sviluppare approcci regioselettivi ma allo stesso tempo relativamente semplici e ad alta resa. La strategia generale per la sintesi dei derivati della quercetina ha pertanto richiesto passaggi di protezione/deprotezione selettiva delle funzionalità ossidriliche (Capitoli 1 e 3). I composti sintetizzati si sono comportati come previsto in saggi in vitro, nei quali è stato possibile verificare un effettivo accumulo in organelli subcellulari a morfologia mitocondriale (Capitoli 1 e 2). Le possibili applicazioni in campo biomedico dei derivati “mitocondriotropici” possono essere interessanti sia nel caso prevalga una loro azione anti-ossidante/citoprotettiva che pro-ossidante/citotossica. Una prima indagine su quale sia l’effetto biologico di questi nuovi composti è stata condotta con mitocondri isolati, utilizzando due derivati della quercetina modificati in posizione 3, ovvero il 3-O-(4-trifenilfosfoniobutil) quercetina ioduro (3-QBTPI), e il suo analogo peracetilato (3-QTABTPI). In accordo con osservazioni fatte in precedenza con la quercetina, questi composti si sono rivelati potenziali co-induttori della transizione di permeabilità mitocondriale e inibitori dell’ATP sintasi mitocondriale (Capitolo 4). Per verificare la rilevanza della posizione occupata dal sostituente sullo scheletro della quercetina ho inoltre sintetizzato l’isomero mitocondriotropico di 3-QBTPI recante la funzionalizzazione con il fosfonio in posizione 7 (Capitolo 3). E’ stata quindi eseguita una caratterizzazione del comportamento redox dei due isomeri mitocondriotropici 3- e 7-(4-O-trifenilfosfoniobutil) quercetina ioduro. Sia nella determinazione del potenziale anodico di ossidazione che nel saggio di attività antiossidante utilizzando l’1,1-difenil-2-picrilidrazil (DPPH), l’isomero 7-sostituito si è comportato in maniera simile alla quercetina, mentre l’isomero 3-sostituito è risultato meno reattivo. Il derivato 7-sostituito ha inoltre manifestato una maggiore attività citotossica nei saggi di vitalità cellulare effettuati: è stato quindi selezionato come candidato ideale per ulteriori studi (Capitolo 5). I derivati mitocondriotropici della quercetina inducono processi di morte cellulare non programmata (necrosi) e agiscono da proossidanti, generando anione superossido nei mitocondri. La morte cellulare è causata dalla generazione di superossido. L’induzione della necrosi è selettiva e colpisce cellule di tipo tumorale (C-26) e fibroblasti embrionali murini a crescita rapida (MEF) ma non fibroblasti embrionali murini a crescita lenta. Quantificazioni del contenuto mitocondriale e della produzione di superossido suggeriscono che la selettività dell’effetto citotossico potrebbe essere messa in relazione con la concentrazione di superossido mitocondriale (Capitolo 6). Prodrugs di polifenoli. L’interesse per questi derivati nasce dall’idea di utilizzare reazioni comuni nella sintesi organica per sintetizzare derivati del resveratrolo, il polifenolo modello utilizzato per questo studio, recanti gruppi protettori sulle funzionalità ossidriliche. Lo scopo di questa protezione è di rallentare o eliminare i processi metabolici in fase di assorbimento, ottenendo quindi livelli sistemici del polifenolo più elevati in seguito alla rimozione dei gruppi protettori per idrolisi catalizzata da enzimi ubiquitari. La strategia adottata inizialmente è basata sulla protezione degli ossidrili mediante legami di tipo carbossiestereo e ha prodotto diversi derivati del resveratrolo (Capitolo 7). Studi di stabilità in sangue, in vivo (farmacocinetiche nel ratto) ed ex vivo (camerette di Ussing) hanno però dimostrato che questo gruppo protettore è inadatto ai nostri scopi, in quanto troppo velocemente idrolizzato da attività esterasiche aspecifiche del sangue e della superficie intestinale. Sono stati quindi selezionati altri tipi di legame da utilizzare per la protezione reversibile degli ossidrili e per realizzare derivati meno suscettibili all’idrolisi di quanto non siano i derivati carbossiesterei. Il primo tipo di legame saggiato è stato l’estere metansolfonico (mesilato) (–O(SO2)CH3) (Capitolo 7). Questo derivato si è dimostrato stabile in saggi in vitro a differenza dei derivati carbossiesterei che si idrolizzano lentamente in soluzioni a pH simili a quelli di stomaco e intestino e si convertono rapidamente a resveratrolo in sangue murino. In esperimenti di permeazione ex vivo utilizzando segmenti di intestino di ratto espiantati e montati in camerette di Ussing i derivati carbossiesterei si ritrovano nel comparto basolaterale essenzialmente come una miscela di metaboliti. Il precursore trimesilato si ritrova invece nel comparto basolaterale senza che sia possibile evidenziare prodotti di idrolisi o modificazioni metaboliche dovute al passaggio della parete intestinale. Esperimenti preliminari di farmacocinetica hanno suggerito che questo tipo di legame è troppo stabile e non suscettibile di idrolisi enzimatica anche in vivo, impedendo quindi la rigenerazione della forma attiva del polifenolo. Risultati analoghi sono stati ottenuti con il secondo tipo di derivati sintetizzato in cui gli ossidrili del resveratrolo sono stati protetti da funzionalità alchil eteree. I polifenoli sono scarsamente solubili in acqua, e la solubilità è un fattore determinante per la biodisponibilità di un composto e per una comoda somministrazione. Abbiamo quindi sintetizzato un primo derivato del resveratrolo (RGS) legando gli ossidrili del polifenolo al glucosio mediante un ponte succinico (Capitolo 8). Studi di farmacocinetica con questo composto dimostrano che l’assorbimento è ritardato rispetto al resveratrolo, un risultato potenzialmente utile. I livelli e la natura dei metaboliti in circolo sono però del tutto analoghi a quelli ottenuti somministrando resveratrolo; questo risultato suggerisce che il derivato subisca idrolisi a resveratrolo nel tratto intestinale, prima dell’assorbimento, compatibilmente con la nota instabilità del legame carbossiestereo in vivo. Derivati della daidzeina. Durante un periodo di sei mesi (marzo/agosto 2010) presso il gruppo di ricerca del Prof. Alan Kozikowski alla UIC (University of Illinois at Chicago) ho effettuato la sintesi di alcuni nuovi derivati della daidzeina, un importante polifenolo naturale appartenente alla famiglia degli isoflavoni della soia. La daidzeina induce l’espressione dell’arginasi 1 (Arg 1), un enzima coinvolto nella biosintesi delle poliammine, che hanno un ruolo protettivo e favoriscono la rigenerazione di neuriti nel sistema nervoso centrale traumatizzato. Essa inoltre è un ben noto agonista del recettore estrogenico β e può agire anche da inibitore delle istone deacetilasi (HDACs), enzimi coinvolti nella regolazione dell’espressione genica. Abbiamo quindi cercato di combinare in una sola molecola queste varie proprietà, producendo dei derivati che inducessero l’espressione di Arg1 rimanendo comunque capaci di interagire con il recettore degli estrogeni, e con una maggiore affinità per le HDACs. Per potenziare l’attività inibitoria nei confronti di questi ultimi enzimi ho unito la funzionalità dell’acido idrossammico allo scheletro molecolare della daidzeina, usando strumenti chimici come l’addizione di Michael sulla daidzeina protetta e la “click chemistry”. La ritenzione della struttura dell’isoflavone e le funzionalità ossidriliche libere dovrebbero assicurare la ritenzione dell’attività estrogenica. In cinque passaggi sintetici sono giunto a quattro prodotti stereoisomerici, la cui farmacologia è ancora sotto studio.