SVILUPPO DI SISTEMI MICROPARTICELLARI PER IL RILASCIO INTRAARTICOLARE PROLUNGATO DI CITOCHINE ANTIINFIAMMATORIE PER LA TERAPIA DELLE PATOLOGIE REUMATICHE

Purpose: The aim of our study is to develop a long lasting biotech drug delivery system for intraartcular (IA) treatment of rheumatic diseases as rheumatoid arthritis and osteoarthritis. The study was focused on preparation of microparticles formulated with biocompatible/biodegradable polymers (PLGA and PLA). Recombinant Human IL-1Ra was used as biotechnological drug model. Introduction: Polymeric microparticles have been widely studied as drug delivery systems for biotech drugs. These formulation can guarantee long term stability of the drug and sustained release allowing for therapeutic protocol optimisation. Nevertheless, protein formulation is usually complicated by the low stability of these fragile molecules which easily undergo denaturation and inactivation under harsh manipulation conditions. The set up of proper procedures which preserve the protein activity is essential to achieve effective products. Experimental: In the present research work, the preparation of biodegradable polymeric microparticles was investigated by using several techniques: emulsion/evaporation, double emulsion/evaporation, suspension/evaporation, nanoprecipitation, spray-drying. In a systematic study, various excipient combinations (PLA, PLGA, PLGAH, PEG, Tristearin, Hyaluronic Acid, Poloxamers etc.) and operative conditions (polymer and protein concentration, instrument set up etc.) were evaluated in order to point out the main critical parameters which dictate the physicochemical properties of the preparations. The products were characterised for their morphological and dimensional properties, drug loading and release were assessed. In vitro release of Il-1Ra from microparticles was evaluated by suspension in buffer and synovial fluid using RP-HPLC and ELISA methods. Pharmacokinetic of IL-1Ra was studied in mice using ELISA methods. Therapeutic efficacy of IL-1Ra loaded microspheres was tested using an animal model of collagen inducted arthritis. Results: Many kind of formulations were obtained using different kind of biocompatible polymers, different ratios between components, different polymers concentrations and procedures of preparation. Spray-drying techniques were the most efficient as they achieved for product yeld, drug loading and narrow dimensional polydispersivity. The preparation of protein suspensions in organic solvent solution of PLA or PLGA and PEG yielded microparticles with size ranging from 1 to 30 m which were suitable for IA administration. The main critical parameters affecting the biopharmaceutical properties of the formulations were: PEG molecular weight and content in the organic solution, PLA or PLGA concentration in the organic solution, type of PLGA and spray feed rate. Under optimized conditions, spherical and homogeneous microparticles in a size range between 2 and 15m were obtained with about 70% drug loading; the microspheres were formed by PLGA (75%), Epikuron 200SH (5%), PEG 5kDa (10%) and IL-Ra (10%). Pharmacokinetic studies demonstrated that microsphere formulation permitted a prolonged in vivo release of IL-1Ra. The use of animal model of collagen inducted arthritis underlined that the injection of IL-1Ra loaded microspheres permits the reduction of Anakinra treatment rate. Conclusion: Spray Drying is a suitable method to obtain drug delivery systems for the prolonged release of biotechnological products such as cytokines and monoclonal antibodies. The physicochemical properties of the products can be tailored by changing different process conditions and formulation composition.

Scopo: Lo scopo di questo studio è stato quello di sviluppare un sistema a rilascio prolungato per il delivery di farmaci biotecnologici per il trattamento intraarticolare (IA) delle patologie infiammatorie croniche come l’artrite reumatoide e l’osteoartrosi. Lo studio è stato focalizzato sulla preparazione di microparticelle costituite da polimeri biodegradabili e biocompatibili (PLGA, PLA e derivati dell’acido ialuronico). IL-1Ra umano ricombinante (anakinra) è stato utilizzato come modello di farmaco biotecnologico ad azione antiinfiammatoria per il suo ruolo fondamentale di antagonista del recettore per l’IL-1, citochina della quale è noto il ruolo chiave proinfiammatorio nelle patologie reumatiche croniche. Introduzione: Le microparticelle polimeriche sono state ampiamente studiate come sistemi di drug delivery per i farmaci biotecnologici. Questo tipo di formulazioni può garantire la stabilità nel tempo del farmaco e un lento rilascio che consente di ottimizzare il protocollo terapeutico. Tuttavia, la formulazione di proteine è solitamente complicata dalla scarsa stabilità di queste fragili molecole che vanno incontro a denaturazione ed inattivazione se sottoposte a condizioni operative drastiche. La messa a punto di opportune procedure che conservino l’attività delle proteine è essenziale per ottenere prodotti efficaci. Materiali e Metodi: La preparazione di microparticelle a base di polimeri biodegradabili è stata studiata utilizzando diverse tecniche: nanoprecipitazione, emulsione ed estrazione della fase interna, emulsione ed evaporazione, doppia emulsione ed evaporazione, spray drying. Varie combinazioni di eccipienti (PLA, PLGA, PLGA-H, PEG, tristearina, acido ialuronico e derivati, Polossamero, fosfatidilcolina) e diverse condizioni operative (concentrazione del polimero e della proteina, settaggio della strumentazione ecc) sono state valutate al fine di evidenziare i principali parametri critici che determinano le proprietà chimico-fisiche della preparazione. I prodotti sono stati caratterizzati per le loro proprietà morfologiche e dimensionali, e sono stati valutati il caricamento e il rilascio del farmaco. Il rilascio in vitro di IL-1RA dalle microparticelle in tampone fisiologico o liquido sinoviale è stato valutato utilizzando tecniche come RP-HPLC ed ELISA. La cinetica di rilascio in vivo di IL-1Ra dalle microsfere è stata valutata mediante metodi ELISA. Sono stati effettuati degli studi di efficacia terapeutica della formulazione utilizzando un modello animale di artrite da collagene (C.I.A.); i diversi gruppi di animali sono stati trattati con diverse dosi di microsfere o di Kineret, e con frequenze diverse di somministrazione. Sono stati valutati il paw score, il peso, diametro dell’articolazione della caviglia e la tumefazione del femore. Risultati: Sono stati ottenute tipologie differenti di formulazioni utilizzando diversi tipi di polimeri biocompatibili, diversi rapporti tra i componenti, diverse concentrazioni di polimero e differenti procedure di preparazione. La tecnica di spray drying è risultata la più efficace in termini di resa, di caricamento del farmaco e di polidispersività dimensionale. La preparazione mediante spray drying di microsfere a partire da sospensioni di liofilizzati di IL-1Ra/PEG in soluzioni organiche di PLA o PLGA ha permesso l’ottenimento di microparticelle con dimensioni comprese tra 1 e 30m, compatibili con l’uso iniettabile. Si è verificato che i principali parametri critici che possono influenzare le proprietà biofarmaceutiche delle formulazioni sono: peso molecolare del PEG utilizzato e rapporto PEG/IL-1Ra nel liofilizzato, concentrazione di PLA o PLGA nel solvente organico, tipo di PLGA e velocità di alimentazione dell’ugello dello strumento. L’ottimizzazione di questi parametri ha permesso di ottenere microsfere di dimensioni adatte all’iniezione intraarticolare (2-15m) e con un elevata efficienza di caricamento del farmaco (50-70%); queste microparticelle sono costituite da 75% p/p di PLGA (in soluzione organica al 4%), 5% p/p di Epikuron 200SH (fosfatidilcolina), 10% p/p di PEG 5kDa e 10% p/p di IL-1Ra. Gli studi di farmacocinetica in topi Balb/c hanno evidenziato che, negli animali trattati con microsfere caricate con citochina, la concentrazione plasmatica di IL-1Ra decresce molto più lentamente che negli animali trattati con il prodotto commerciale Kineret® (anakinra); dopo 24h dalla somministrazione di Kineret, infatti, non vi è più traccia rilevabile di IL-1Ra nel plasma, mentre, dopo somministrazione di microsfere caricate con IL-1Ra, si rileva presenza di citochina per tempi superiori alle 48h. L’utilizzo del modello animale di artrite sperimentale ha permesso di valutare l’efficacia terapeutica delle microsfere: la somministrazione di microsfere caricate con IL-1Ra consente di ridurre la frequenza di trattamento ottenendo risultati confrontabili ad una iniezione giornaliera di Kineret. Conclusione: Il metodo di sospensione e spray drying sviluppato è adatto all’ottenimento di sistemi per il rilascio prolungato di prodotti biotecnologici come citochine, anticorpi monoclonali e proteine di fusione. Le caratteristiche chimico-fisiche dei prodotti possono essere modificate e adattate allo scopo desiderato variando le condizioni di processo e la composizione della formulazione.