I FLAVONOIDI COME FONTE DI SOSTANZE ANTIOSSIDANTI: STUDI SU COLTURE CELLULARI UMANE

UV radiation and in particular its UVB component, is an important environmental factor in the pathogenesis of skin aging and cancer. One of the features of UVB-caused DNA damage is the formation of cyclobutane pyrimidine dimers and (6-4) photoproducts. Further, indirect DNA damage is also caused by increase in the level of reactive oxygen species (ROS) that cause oxidative damage reacting with DNA, proteins, fatty acids and saccharides. Such injuries result in a number of harmful effects: disturbance of cell metabolism, morphological and ultrastructural changes, alterations in the regulation pathways in differentiation, proliferation and apoptosis of skin cells. These processes can lead to photoaging and skin cancer development. In order to avoid UVB radiation damage, phytocompounds and antioxidants as photoprotectives has been considered. In recent years naturally occurring herbal compounds such as phenolic acids, flavonoids, and high molecular weight polyphenols have gained remarkable attention as strong protective agents. In particular different natural compounds prevent the occurrence and reduced the severity of UV-induced photoaging and diseases of the skin. In the present study we have investigated the anti-oxidant and anti-apoptotic effect of forty-five phytochemicals in UVB-irradiated normal human keratinocytes and melanocytes. In the first part of our study we assessed the activity of these compounds on UVB-irradiated normal human keratinocytes and melanocytes. These substances were submitted to a primary in vitro screening by MTT test in order to valuate proliferation rate. Subsequently, we examined in cultured epidermal cells the effects of UVB doses at 50mJ/cm2. In particular 2’7’- dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCF) assay was performed to determine formation of intracellular ROS. The results showed that kaempferol, 18β-glycyrrhetinic acid and glabridin presented interesting properties in both cell lines tested. In the second part of our study we investigated the antiapoptotic effects of these three compounds in UVB-irradiated normal human keratinocytes and melanocytes by western blot and cell cycle analysis. The results showed that pre-treatment of human keratinocytes and melanocytes with these phytocompounds inhibited UVB mediated cell cycle arrest. This result was confirmed by western blot analysis of p53 and p21 protein levels. To further elucidate the molecular mechanism of phytocompounds, we have decided to investigate the extrinsic and intrinsic apoptotic pathways. The results showed that pre-treatment of human keratinocytes and melanocytes with these phytocompounds inhibited UVB mediated apoptosis through involvement of bcl-2 and bid protein, caspase-8 and -9, inhibition of PARP cleavage. Human skin is constantly exposed to the UV radiation present in sunlight. This may induce a number of phatobiological cellular changes. The development of novel preventive and therapeutic strategies depends on our understanding of the molecular mechanism of UV-damage. Phytochemical that were identified may be candidates for prevention of adverse effects of UV radiation on the skin and evaluation of there clinical efficacy is awaited.

La radiazione UV, in particolare la sua componente dovuta agli UVB, è un importante fattore implicato nella patogenesi dell’invecchiamento cutaneo e del cancro. Uno degli aspetti legato al danno indotto dagli UVB è la formazione dei dimeri di ciclobutano pirimidina e dei fotoprodotti pirimidina (6-4) pirimidone. Inoltre, le radiazioni UV sono in grado di indurre un danno indiretto al DNA attraverso un incremento dei livelli delle specie reattive dell’ossigeno (ROS) che di conseguenza causano danno ossidativo reagendo con DNA, proteine, acidi grassi e zuccheri. Tali danni inducono diversi effetti avversi: disturbo del metabolismo cellulare, cambiamenti morfologici ed ultrastrutturali, attacco delle vie di regolazione e alterazioni nella differenziazione e proliferazione cellulare, apoptosi delle cellule cutanee. Per evitare i danni indotti dalla radiazione UVB, sono stati presi in considerazione come agenti fotoprotettivi, fotocomposti e molecole antiossidanti. Negli ultimi anni molte ricerche hanno rivolto la loro attenzione alle molecole naturali estraibili dalle piante e caratterizzate da una elevata azione antiossidante. Si tratta di acidi fenolici, i flavonoidi e i polifenoli ad alto peso molecolare. In particolare è stato dimostrato che differenti composti naturali sono in grado di prevenire gli effetti e ridurre la severità del fotoinvecchiamento e le patologie cutanee indotte dagli UV. Nel presente studio sono stati investigati l’effetto antiossidante ed antiapoptotico di 45 fitoprodotti naturali in colture di cheratinociti e melanociti umani normali irradiati con raggi di tipo UVB. Nella prima parte dello studio è stata valutata l’attività di queste molecole sui cheratinociti e melanociti umani normali. Le 45 sostanze sono state dapprima sottoposte in vitro al test MTT, per valutare l’eventuale attività citotossica. In seguito, sono stati esaminati gli effetti delle medesime molecole sulle cellule esposte radiazione UVB (50mJ/cm2). In particolare è stato effettuato il saggio della 2’7’- diclorodiidrofluoresceina diacetato per determinare la formazione intracellulare di specie reattive dell’ossigeno (ROS). I risultati hanno evidenziato 3 molecole: il kampferolo, l’acido 18β-glicirretinico e la glabridrina caratterizzate da interessante attività protettiva in entrambe le linee cellulari testate. Nella seconda parte di questo studio è stato valutato mediante western-blot e analisi del ciclo cellulare, il potenziale effetto antiapoptotico di questi tre composti nei cheratinociti e melanociti umani normali irradiati con raggi UVB. I risultati mostrano che il pre-trattamento di cheratinociti e melanociti con questi fotocomposti inibisce l’arresto del ciclo cellulare normalmente mediato dagli UVB. Inoltre questo risultato è stato confermato attraverso l’analisi wester-blot dei livelli delle proteine p53 e p21. Per meglio delucidare il meccanismo molecolare con cui i fotocomposti mediano l’apoptosi, sono state studiate le principali vie apoptotiche, estrinseca ed intrinseca. I risultati hanno confermato che il pre-trattamento dei cheratinociti e dei melanociti con questi fotocomposti inibisce l’apoptosi mediata dagli UVB coinvolgendo la down-regolazione di bcl-2 e di bid, il clivaggio delle caspasi -8 e -9 e di PARP. La cute umana è costantemente esposta alle radiazioni UV emesse dai raggi solari. Queste possono indurre diversi cambiamenti cellulari con la possibilità di insorgenza di patologie anche gravi. Lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche e di prevenzione dipende sicuramente dall’approfondimento delle nostre conoscenze sul meccanismo molecolare del danno indotto dai raggi UV. I fitoprodotti identificati in questo lavoro presentano valide caratteristiche per un loro ulteriore sviluppo come molecole utilizzabili nella prevenzione degli effetti avversi indotti dalle radiazioni UV sulla pelle; tuttavia la conferma della suddetta attività richiede una scrupolosa valutazione clinica.