Heparanase e rene. Regolazione e ruolo dell'heparanase a livello tubulare e nella nefropatia diabetica.

Heparanase (HPSE) is an interesting player in the arena of proteinuric disease and several investigators proposed that this enzyme is responsible for heparan sulphate (HS) reduction in glomerular basement membrane in diabetic nephropathy (DN). However, few data are available about HPSE expression, regulation and role in proximal tubular epithelial cells (PTEC), particularly in diabetes. In this study we demonstrate that this molecule is a key mediator in homeostasis of PTEC in diabetic milieu possibly playing a role in the DN pathogenesis. We showed that HPSE is constitutively expressed in PTEC suggesting that it has a physiological role. HPSE is up-regulated by mediators involved in DN such as albumin and glycated albumin (AGE), but not by high-glucose. Albumin and AGE-induced HPSE up-regulation is PI3K/AKT dependent. Albumin and especially AGE cause a significant decrease in HS staining. In order to investigate the effects derived from HPSE up-regulation and distinguish from those caused directly by albumin and AGE we generated a HK2 PTEC line stably silenced for HPSE. In HPSE silenced cells, HS was significantly increased respect to HK2 wt cells and treatment with albumin or AGE had no effect suggesting that in tubular cells, HS levels depend on HPSE regulation. We also discovered that HS levels aren't regulated only by the cleaving activity of the endoglycosidase HPSE but also from the regulation of HSPG core proteins. In fact, Syndecan-1 core protein and mRNA expression were down-regulated by albumin and AGE in w.t. tubular cells while in HPSE silenced cells they failed to induce any Syndecan-1 modulation. Moreover in untreated HPSE silenced cells, Syndecan-1 is up-regulated at both gene transcription and protein expression in comparison with w.t. cells. Preliminary data also indicate that HPSE is involved in the regulation of FGF-2 signaling. We has also verified that exist a correlation between heparanase and metalloproteinases (MMP), infact in HPSE-silenced cells these extracellular matrix degrading enzymes results down-regulated both at gene transcription and activity levels in comparison with wt cells. MMPs are also up-regulated by albumin and AGE stimulation in a heparanase-independet way. In conclusion, we showed that HPSE is implicated in different mechanisms possibly involved in the tubulointerstitial damage of the DN. We have alco confirmed that Sulodexide, a drug commonly used in DN treatment which is effective in reducing proteinuria, is a potent heparanase inhibitor with a IC50 of 50mg/ml. Finally, we observed that heparanase plasma activity is up-regulated in nephropatic patient, expecially in transplant rejection, respect to healthy subjects. These data must be related to other parameter of kidney functionality to recognize heparanase activity as a useful marker of nephropathy.

L'heparanase (HPSE) sta emergendo come un importante fattore nel complesso sistema delle nefropatie proteinuriche e percio diversi autori hanno suggerito che questo enzima possa essere responsabile della riduzione dell'heparan solfato (HS) nella membrana basale glomerulare nel corso della nefropatia diabetica (ND). Attualmente sono disponibili poche informazioni riguardo l'espressione, la regolazione e il ruolo dell'heparanase nelle cellule epiteliali del tubulo prossimale (PTEC) in particolare nel diabete. In questo studio è stato dimostrato che questo enzima è un mediatore chiave nell'omeostasi delle PTEC nell'ambiente diabetico e può svolgere un ruolo nella patogenesi della ND. È stato evidenziato che l'heparanase è espressa costitutivamente nelle PTEC suggerendo che essa svolga un ruolo fisiologico in queste cellule. La sovra-espressione dell'heparanase è mediata da alcuni fattori tipici della ND, quali l'albumina e i prodotti di avanzata glicazione (AGE), ma non dall'alto glucosio. L'albumina e gli AGE portatano alla sovra-espressione dell'heparanase attraverso la via PI3K/AKT. L'albumina e particolarmente gli AGE causano una significativa riduzione dell'HS. Al fine di discriminare gli effetti dovuti alla sovra-espressione dell'heparanase da quelli causati direttamente dall'albumina e dagli AGE abbiamo generato una linea cellulare (HK2) stabilmente silenziata per l'heparanase. Nelle cellule HPSE-silenziate l'HS è significativamente aumentato rispetto alle cellule HK2 wt e il trattamento con albumina e AGE non ha prodotto effetti suggerendo che nelle PTEC i livelli di HS dipendono dalla regolazione dell'heparanase. È inoltre emerso che i livelli di HS non sono regolati solamente dall'attività endoglicosidasica dell'heparanase ma anche dalla regolazione del core proteico dei proteoglicani dell'HS. Infatti, il core proteico del sindecano-1 e la sua espressione genica sono ridotte nelle cellule tubulari wt trattate con albumina ed AGE mentre nelle cellule HPSE silenziate questi mediatori non riescono ad indurre alcuna modulazione del sindecano-1. Nelle cellule HPSE-silenziate, inoltre, il sindecano-1 risulta significativamente incrementato sia a livello di trascrizione genica che della relativa espressione proteica rispetto alle cellule wt. Ulteriori dati confermano che l'heparanase è coinvolta nelle vie di trasduzione del segnale dell'FGF-2. È stato poi verificato che esiste una correlazione fra heparanase e metalloproteasi (MMP), infatti nelle cellule HPSE silenziate questi enzimi di degradazione della matrice extracellulare risultano ridotti sia a livello di espressione genica che di attività . Anche le MMP risultano incrementate dalla stimolazione con albumina e AGE ma in maniera indipendente dall'heparanase. Inoltre il Sulodexide, un farmaco comunemente usato nel trattamento della ND e che è risultato efficace nel ridurre la proteinuria, è effettivamente un buon inibitore dell'heparanase con un IC50 di 50mg/ml. Infine è stato osservato che l'attività plasmatica dell'heparanase risulta aumentata in pazienti con nefropatie, speciamemte in pazienti con rigetto di trapianto, rispetto a soggetti sani. Al fine di evidenziare l'utilita di questi valori come marcatori di qualche condizione nefropatica dovranno essere correlati ad altri parametri di funzionalià renale. In conclusione, si ritiene di avere dimostrato un ruolo attivo dell'l'heparanase nei meccanismi di danno e patogenesi della ND.