Ottimizzazione di vescicole biomimetiche per il trattamento di tumori solidi e stati infiammatori nel bambimo e nell'adulto

In the past, many studies developed nanovectors for drug delivery using many different materials, both synthetic and natural. Most systems have been designed so far using a “bottom-up” approach, in which the nanovector components are assembled to achieve a more complex behavior. The complexity of these systems can make this strategy cumbersome and difficult to scale-up. The use of biomimetic nanovesicles complements this strategy with a “top-down” approach, in which membrane proteins derived from cells are engrafted within the particles’ phospholipid bilayer. In this study, leukocyte membranes functionalized nanovesicles named Leukosomes (Leuko) are formulated as innovative drug delivery vectors to target inflammation and solid tumors. The use of membrane proteins of white blood cells bestows Leuko with the leukocytes’ ability to circulate in the blood for long time, and to adhere to the endothelia of inflamed blood vessels. The first step of this project was the optimization of a fast, cheap and reproducible protocol for the extraction and purification of membrane proteins form leukocytes. We optimized a detergent-based protocol for the purification of membrane proteins from human and murine cells. We measured the total protein yield using our protocol with two different detergent concentrations and compared it to a commercial kit. We further assessed membrane protein enrichment by comparing markers for specific cellular components using SDS- PAGE/western blot and identifying specific proteins by qualitative mass spectrometry. Our protocol led to a final protein yield analogous to the commercial kit based on a similar workflow, and the same, or in some instances better, membrane protein purity. After the optimization of membrane proteins extraction, the second step was use them to formulate Leuko. Leuko features should be optimized to make them suitable for in vitro testing, including nano range size, a homogeneous size distribution (PDI) and efficient membrane proteins engraftment. We employed the Nanoassemblr TM platform that allows the fast and scalable self-assembly of Leuko. However, the experimental parameters for this process, including the microfluidics conditions and the proteins to lipids weight ratio should be optimized to yield Leuko with the desired features. Thus, Leuko size, PDI and protein loading were optimized using a Design of Experiment (DoE) approach to select the optimal parametric values with the minimal number of experimental runs to predict Leuko features depending on the experimental parameters employed. After performing the experimental runs and calculating the optimal parametric values, we validated the new Leuko formulation features with DLS and particle tracking analysis. Membrane proteins functionalization was confirmed sing flow cytometry with a wide screen of antibodies for several immune cells’ markers, confirming both their presence and correct orientation. Leuko have been then loaded with the model antitumor drug Doxorubicin using a remote loading strategy that yielded a 60% encapsulation efficiency. DOXO release kinetics showed a gradual and pH-dependent release profile. In the last part of the project, we demonstrated Leuko ability to adhere to inflamed endothelial cells using fluorescence microscopy, as well as their internalization rate in osteosarcoma SAOS-2 cells and colorectal cancer HCT-116 cells. Finally, we tested the cytotoxicity of Lipo and Leuko loaded with DOXO on the above-mentioned cancer cell lines, using both flat cell culture conditions and tumor spheroids. DOXO loaded Leuko showed on both models improved cytotoxic effect to free DOXO against tumor cells. The results of this project constitute a proof of concept of a new framework for the optimization of biomimetic drug delivery systems formulated using different starting cell lines and with different potential applications in a wide set of pathologies.

Molti nanovettori per la somministrazione di farmaci sono stati formulati con diversi materiali. La maggior parte di tali vettori è stata progettata con un approccio "bottom up" in cui i componenti sono assemblati per ottenere un comportamento complesso. La complessità di questi sistemi può però rendere questa strategia complicata e difficile da scalare industrialmente. Le particelle biomimetiche complementano questa strategia con un approccio "top-down", in cui proteine di membrana derivate da cellule sono innestate sulle superficie di particelle. In questo studio, nanovescicole funzionalizzate con membrane leucocitarie denominate Leukosomes (Leuko) sono formulate come vettori innovativi di farmaco per colpire l'infiammazione e i tumori solidi. L'uso di proteine di membrana leucocitarie conferisce ai Leuko la capacità dei leucociti di circolare nel sangue a lungo e di aderire all'endotelio dei vasi sanguigni infiammati. Il primo passo di questo progetto è stata l'ottimizzazione di un protocollo veloce, economico e riproducibile per l'estrazione e la purificazione delle proteine di membrana dai leucociti. In particolare, abbiamo ottimizzato un protocollo di estrazione a base di detergenti su cellule umane e murine. Abbiamo misurato la resa proteica utilizzando il nostro protocollo e l'abbiamo confrontata con un kit commerciale. Abbiamo valutato l'arricchimento delle proteine confrontando i marcatori per compartimenti cellulari specifici tramite SDS-PAGE/western blot e identificando proteine specifiche mediante spettrometria di massa. Il nostro protocollo ha una resa proteica finale analoga al kit commerciale, e la stessa purezza delle proteine di membrana. Il secondo passaggio del progetto è stato l’utilizzo di tali proteine per formulare i Leuko. Le caratteristiche dei Leuko devono essere ottimizzate per renderli adatti ai test in vitro: le dimensioni nanometriche, una distribuzione dimensionale omogenea (PDI) e un efficiente caricamento di proteine di membrana. Abbiamo utilizzato la piattaforma Nanoassemblr che consente l'autoassemblaggio veloce e scalabile di Leuko. Tuttavia, i parametri sperimentali per questo processo, comprese le condizioni di microfluidica e il rapporto tra proteine e lipidi, devono essere ottimizzati per produrre Leuko con le caratteristiche desiderate. Pertanto, le dimensioni di Leuko, il PDI e il carico proteico sono stati ottimizzati utilizzando un approccio Design of Experiment (DoE) per selezionare i valori parametrici ottimali con il numero minimo di esecuzioni sperimentali per prevedere le caratteristiche di Leuko. Dopo aver eseguito le prove sperimentali e calcolato i valori parametrici ottimali, abbiamo convalidato le caratteristiche dei Leuko con DLS. Il caricamento delle proteine di membrana è stato confermato tramite citofluorimetria con anticorpi per marcatori leucocitari, confermando la loro presenza e il corretto orientamento. I Leuko sono stati quindi caricati con il farmaco antitumorale Doxorubicina (DOXO) tramite caricamento remoto con un'efficienza di incapsulamento del 60%. La cinetica di rilascio della DOXO ha mostrato un profilo di rilascio graduale e dipendente dal pH. Nell'ultima parte, abbiamo dimostrato la capacità dei Leuko di aderire alle cellule endoteliali infiammate utilizzando, nonché il loro tasso di internalizzazione nelle cellule SAOS-2 di osteosarcoma e nelle cellule HCT-116 di cancro del colon-retto. Infine, abbiamo testato la citotossicità di Lipo e Leuko caricati con DOXO su linee cellulari tumorali sopra menzionate, utilizzando condizioni di coltura cellulare piatta e sferoidi tumorali. Leuko caricato con DOXO ha mostrato su entrambi i modelli un effetto citotossico migliore rispetto alla DOXO libera. I risultati di questo progetto costituiscono un proof of concept di un nuovo framework per l'ottimizzazione di sistemi biomimetici formulati con diverse linee cellulari di partenza e con molte possibili applicazioni in un'ampia serie di patologie.