Coenzyme Q10 (CoQ10) is an essential electron shuttle in mitochondrial respiratory chain and its deficiency cause severe multisystemic disorders. Primary CoQ10 deficiency is a clinically and genetically heterogeneous disorder due to reduced levels of CoQ10 in tissues and associated with several diseases, such as fatal neonatal encephalopathy, steroid-resistant nephrotic syndrome (SRNS), hypertrophic cardiomyopathy (HCM), retinopathy or optic atrophy and sensorineural hearing loss. The cause of low CoQ10 levels in tissues and organs could be the presence of mutations in the so called “COQ genes”, which encode for proteins involved in CoQ10 biosynthesis. Many studies about CoQ biosynthesis have been conducted on Saccharomyces cerevisiae, a model organism which have been an essential starting point for functional characterization of many COQ proteins. However, CoQ10 biosynthetic process, all proteins involved, and their precise function have not been fully understood yet. Two of these genes are COQ10A and COQ10B (hortologs of S. cerevisiae Coq10 gene), they are putatively involved in CoQ10 biosynthesis, but their function is still completely unknown in humans. The aim of this work is to develop an efficient and easy-to-handle model to study COQ10A and COQ10B function in human cells, to better clarify CoQ10 biosynthetic process and likely find new therapeutic targets for patients with primary CoQ10 deficiency. To accomplish this, we employed CRISPR/Cas9 technology in Human Embryonic Kidney (HEK) 293 cell line in order to generate three different cellular knockout (KO) cell lines: COQ10A KO, COQ10B KO and COQ10AB KO, in which one or both genes were disrupted to impair their correct transcription and translation into functional proteins. KO cell lines were functionally characterized, in particular COQ10AB KO cell line, since it presented a more severe phenotype and no risk of functional compensation between the two genes. All three KO cell lines presented physiological levels of endogenous CoQ10 and a slightly reduced activity of mitochondrial respiratory complexes III and II+III. Only COQ10AB KO showed a subtle difference in complex III assembly in the analysis of mitochondrial supercomplexes. COQ10AB KO cell line had also normal complex V activity in gel, higher levels of reactive oxygen species (ROS) and highly impaired oxidative phosphorylation compared to wild type cells. Very interestingly, exogenous supplementation with Q10 did not rescue COQ10AB KO cells respiration, while Q6 addition partially restore respiration and supplementation with Q4 leads to a fully recovered mitochondrial respiration. These data question the role of COQ10A and B in Coenzyme Q10 biosynthesis and lead to a completely new hypothesis about the role of COQ10A and COQ10B in human cells metabolism.

Il Coenzima Q10 (CoQ10) è un trasportatore di elettroni essenziale nella catena respiratoria mitocondriale e la carenza di tale coenzima causa gravi malattie multi-sistemiche. La deficienza primaria di coenzima Q10 è una malattia eterogenea sia dal punto di vista clinico sia genetico, dovuta alla riduzione dei livelli di CoQ10 nei tessuti e associata a diverse patologie, quali l’encefalopatia neonatale fatale, la sindrome nefrosica resistente a steroidi (SRNS), la cardiomiopatia ipertrofica (HCM), la retinopatia o atrofia ottica e l’ipoacusia neurosensoriale. I bassi livelli di CoQ10 in organi e tessuti possono essere dovuti alla presenza di mutazioni nei geni chiamati “geni COQ”, i quali codificano per proteine coinvolte nella biosintesi del coenzima Q10. Molti studi riguardanti la biosintesi del coenzima Q sono stati condotti in Saccharomyces cerevisiae, un organismo modello che è stato un punto di partenza essenziale per la caratterizzazione funzionale di molte proteine COQ. In ogni caso, il processo di biosintesi del coenzima Q10, tutte le proteine coinvolte e la loro funzione precisa non sono stati ancora compresi del tutto. Due tra questi geni sono COQ10A e COQ10B (ortologi del gene Coq10 di S. cerevisiae), i quali si ipotizza possano essere coinvolti nella biosintesi del CoQ, ma la cui la funzione in cellule umane è ancora completamente sconosciuta. Lo scopo di questo lavoro è quello di sviluppare un modello efficiente e facile da maneggiare per lo studio della funzione dei geni COQ10A e COQ10B in cellule umane, per comprendere meglio il processo di biosintesi del CoQ10 e possibilmente trovare nuovi target terapeutici per pazienti affetti da deficienza primaria di CoQ10. Per raggiungere questo obbiettivo, abbiamo utilizzato la tecnologia CRISPR/Cas9 in cellule embrionali umane di rene (HEK 293), con l’intento di generare tre linee cellulari “knockout” (KO): COQ10A KO, COQ10B KO e COQ10AB KO, in cui uno o entrambi i geni COQ10 fossero danneggiati, in modo da impedirne la corretta trascrizione e traduzione in proteina funzionante. Le linee KO sono state caratterizzate funzionalmente, in particolare la linea COQ10AB KO, dato che presentava un fenotipo più severo e non vi era il rischio che ci fosse complementazione funzionale tra i due geni. Tutte e tre le linee cellulari KO presentavano livelli fisiologici di Q10 endogeno e un’attività dei complessi respiratori mitocondriali III e II+III leggermente ridotta. Solo le cellule COQ10AB KO mostravano una sottile differenza nell’assemblaggio del complesso III nei supercomplessi mitocondriali. Le cellule COQ10AB KO presentavano inoltre una normale attività in gel del complesso V, alti livelli di specie reattive dell’ossigeno (ROS) e una fosforilazione ossidativa altamente compromessa rispetto alle cellule sane di controllo (wild type). Eccezionalmente, la supplementazione esogena con Q10 non ha portato al recupero della respirazione nelle cellule COQ10AB KO, mentre l’aggiunta di Q6 ne ha ripristinato solo parzialmente la respirazione e invece la supplementazione con Q4 ha portato al completo recupero della respirazione mitocondriale. I dati qui presentati mettono in discussione il ruolo dei geni COQ10A e B nella biosintesi del coenzima Q10 e portano ad un’ipotesi completamente nuova riguardo al ruolo delle proteine COQ10A e COQ10B nel metabolismo cellulare.

Caratterizzazione funzionale di COQ10A e COQ10B umani, due geni essenziali per la respirazione mitocondriale / Baschiera, Elisa. - (2022 Mar 09).

Caratterizzazione funzionale di COQ10A e COQ10B umani, due geni essenziali per la respirazione mitocondriale

BASCHIERA, ELISA
2022

Abstract

Coenzyme Q10 (CoQ10) is an essential electron shuttle in mitochondrial respiratory chain and its deficiency cause severe multisystemic disorders. Primary CoQ10 deficiency is a clinically and genetically heterogeneous disorder due to reduced levels of CoQ10 in tissues and associated with several diseases, such as fatal neonatal encephalopathy, steroid-resistant nephrotic syndrome (SRNS), hypertrophic cardiomyopathy (HCM), retinopathy or optic atrophy and sensorineural hearing loss. The cause of low CoQ10 levels in tissues and organs could be the presence of mutations in the so called “COQ genes”, which encode for proteins involved in CoQ10 biosynthesis. Many studies about CoQ biosynthesis have been conducted on Saccharomyces cerevisiae, a model organism which have been an essential starting point for functional characterization of many COQ proteins. However, CoQ10 biosynthetic process, all proteins involved, and their precise function have not been fully understood yet. Two of these genes are COQ10A and COQ10B (hortologs of S. cerevisiae Coq10 gene), they are putatively involved in CoQ10 biosynthesis, but their function is still completely unknown in humans. The aim of this work is to develop an efficient and easy-to-handle model to study COQ10A and COQ10B function in human cells, to better clarify CoQ10 biosynthetic process and likely find new therapeutic targets for patients with primary CoQ10 deficiency. To accomplish this, we employed CRISPR/Cas9 technology in Human Embryonic Kidney (HEK) 293 cell line in order to generate three different cellular knockout (KO) cell lines: COQ10A KO, COQ10B KO and COQ10AB KO, in which one or both genes were disrupted to impair their correct transcription and translation into functional proteins. KO cell lines were functionally characterized, in particular COQ10AB KO cell line, since it presented a more severe phenotype and no risk of functional compensation between the two genes. All three KO cell lines presented physiological levels of endogenous CoQ10 and a slightly reduced activity of mitochondrial respiratory complexes III and II+III. Only COQ10AB KO showed a subtle difference in complex III assembly in the analysis of mitochondrial supercomplexes. COQ10AB KO cell line had also normal complex V activity in gel, higher levels of reactive oxygen species (ROS) and highly impaired oxidative phosphorylation compared to wild type cells. Very interestingly, exogenous supplementation with Q10 did not rescue COQ10AB KO cells respiration, while Q6 addition partially restore respiration and supplementation with Q4 leads to a fully recovered mitochondrial respiration. These data question the role of COQ10A and B in Coenzyme Q10 biosynthesis and lead to a completely new hypothesis about the role of COQ10A and COQ10B in human cells metabolism.
Functional characterization of human COQ10A and COQ10B, two essential genes for mitochondrial respiration
9-mar-2022
Il Coenzima Q10 (CoQ10) è un trasportatore di elettroni essenziale nella catena respiratoria mitocondriale e la carenza di tale coenzima causa gravi malattie multi-sistemiche. La deficienza primaria di coenzima Q10 è una malattia eterogenea sia dal punto di vista clinico sia genetico, dovuta alla riduzione dei livelli di CoQ10 nei tessuti e associata a diverse patologie, quali l’encefalopatia neonatale fatale, la sindrome nefrosica resistente a steroidi (SRNS), la cardiomiopatia ipertrofica (HCM), la retinopatia o atrofia ottica e l’ipoacusia neurosensoriale. I bassi livelli di CoQ10 in organi e tessuti possono essere dovuti alla presenza di mutazioni nei geni chiamati “geni COQ”, i quali codificano per proteine coinvolte nella biosintesi del coenzima Q10. Molti studi riguardanti la biosintesi del coenzima Q sono stati condotti in Saccharomyces cerevisiae, un organismo modello che è stato un punto di partenza essenziale per la caratterizzazione funzionale di molte proteine COQ. In ogni caso, il processo di biosintesi del coenzima Q10, tutte le proteine coinvolte e la loro funzione precisa non sono stati ancora compresi del tutto. Due tra questi geni sono COQ10A e COQ10B (ortologi del gene Coq10 di S. cerevisiae), i quali si ipotizza possano essere coinvolti nella biosintesi del CoQ, ma la cui la funzione in cellule umane è ancora completamente sconosciuta. Lo scopo di questo lavoro è quello di sviluppare un modello efficiente e facile da maneggiare per lo studio della funzione dei geni COQ10A e COQ10B in cellule umane, per comprendere meglio il processo di biosintesi del CoQ10 e possibilmente trovare nuovi target terapeutici per pazienti affetti da deficienza primaria di CoQ10. Per raggiungere questo obbiettivo, abbiamo utilizzato la tecnologia CRISPR/Cas9 in cellule embrionali umane di rene (HEK 293), con l’intento di generare tre linee cellulari “knockout” (KO): COQ10A KO, COQ10B KO e COQ10AB KO, in cui uno o entrambi i geni COQ10 fossero danneggiati, in modo da impedirne la corretta trascrizione e traduzione in proteina funzionante. Le linee KO sono state caratterizzate funzionalmente, in particolare la linea COQ10AB KO, dato che presentava un fenotipo più severo e non vi era il rischio che ci fosse complementazione funzionale tra i due geni. Tutte e tre le linee cellulari KO presentavano livelli fisiologici di Q10 endogeno e un’attività dei complessi respiratori mitocondriali III e II+III leggermente ridotta. Solo le cellule COQ10AB KO mostravano una sottile differenza nell’assemblaggio del complesso III nei supercomplessi mitocondriali. Le cellule COQ10AB KO presentavano inoltre una normale attività in gel del complesso V, alti livelli di specie reattive dell’ossigeno (ROS) e una fosforilazione ossidativa altamente compromessa rispetto alle cellule sane di controllo (wild type). Eccezionalmente, la supplementazione esogena con Q10 non ha portato al recupero della respirazione nelle cellule COQ10AB KO, mentre l’aggiunta di Q6 ne ha ripristinato solo parzialmente la respirazione e invece la supplementazione con Q4 ha portato al completo recupero della respirazione mitocondriale. I dati qui presentati mettono in discussione il ruolo dei geni COQ10A e B nella biosintesi del coenzima Q10 e portano ad un’ipotesi completamente nuova riguardo al ruolo delle proteine COQ10A e COQ10B nel metabolismo cellulare.
Caratterizzazione funzionale di COQ10A e COQ10B umani, due geni essenziali per la respirazione mitocondriale / Baschiera, Elisa. - (2022 Mar 09).
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