Valutazione dell'impatto ambientale di antimicrobici utilizzati per i trattamenti di massa negli allevamenti

In intensive animal farming, mass medication involves the administration of large quantities of antimicrobial drugs that may be unmetabolized by the animal or metabolized and excreted as active or inactive metabolites. Since the manure from these farms is commonly used for the fertilization of agricultural soil, these treatments may lead to an environmental drug contamination. Subsequently, the residues of active ingredients can be transferred from the soil to surface water through seepage and/or runoff. The environmental consequences of soil fertilization with drug-contaminated manure are a topic of great interest. Indeed, the persistence of antimicrobials in the environment can: 1.represent an ecotoxicological risk for non-target organisms and 2.lead to the emergence and spread of bacterial resistance to antimicrobials (AMR). For the evaluation of the possible effects in non-target organisms, fluoroquinolones (FQs) were selected; two drugs used in veterinary medicine (enrofloxacin and flumequine) and one used in human medicine (levofloxacin) were employed in root-elongation inhibition tests on three terrestrial plants (Lycopersicon esculentum, Lactuca sativa and Daucus carota). All these dicotyledons showed limited sensitivity to the 3 FQs; for this reason, subsequent studies with the same antibiotics were carried out on the model-organism Daphnia magna. Innovative tests were developed and fine-tuned to highlight delayed toxic effects after embryonic or neonatal exposure. The toxicological interactions of the 3 drugs, in binary and ternary mixtures, were also verified. The results showed that the official tests have some limitations, since they lead to an overestimation of the EC50, and that the mixtures of these compounds show a degree of toxicity that can be explained by additive interactions. Another test was a minor contribution to a project of other researchers studying the biocompatibility and therapeutic efficacy of magnetic nanoparticles engineered with flumequine. This nano-immobilized antibiotic represents a promising tool for “green aquaculture”. The core-shell nanocarrier was tested on a D. magna culture naturally infected with bacteria known to be sensitive to the drug: it showed to be effective and relatively non-toxic. Lastly, other research activities concerning FQs represented the launch of a new research project aimed at evaluating the possible epigenetic effects of flumequine (transgenerational toxicity) on D. magna. Preliminary results showed, in addition to the already known toxic effects caused by the drug to the first generation (dwarfism, mortality), phenomena of lethargy and less responsiveness to light sources, occurring in the next two generations non-exposed to the drug. The molecular analysis, currently undertaken by other researchers participating to the project, aims to highlight any alterations of the genome that may justify the various effects observed at the phenotypic level. Regarding the potential spread of antimicrobial resistance following the use of antimicrobials in the livestock sector, animal manure, and agricultural soil before and after fertilization, were investigated. The aim was to evaluate the changes in the composition of the microbial communities in the aforementioned types of samples using NGS analysis and assess the presence and abundance of antimicrobial resistance genes (ARGs) against four antimicrobials classes (i.e., fluoroquinolones, macrolides, polymyxins and β-lactams) by employing gene specific SYBRGreen Real-Time PCRs paired with melting curves analysis. To this end, published assays were used. When not available, new assays were designed and developed (i.e., assays for the detection and quantification of colistin resistance genes, mcr-4 and mcr-5) or optimized and validated with the SYBRGreen chemistry (i.e., assays for the detection and quantification of ermB, blaCTXM1-like, blaCMY-2, qnrA and qnrS genes).

Negli allevamenti intensivi, i trattamenti di massa implicano la somministrazione di grandi quantità di antimicrobici che possono essere non metabolizzati dall’animale o essere metabolizzati ed escreti come metaboliti attivi o inattivi. Poichè le deiezioni provenienti da tali allevamenti vengono comunemente usate per la fertilizzazione dei terreni agricoli, può derivarne una contaminazione ambientale da farmaci. I residui di principi attivi possono poi essere trasferiti dal suolo alle acque superficiali tramite dilavamento o infiltrazione. Le conseguenze ambientali derivanti dalla concimazione del suolo con letame contaminato da farmaci costituiscono un argomento di grande interesse, poiché la persistenza di antimicrobici nell'ambiente può rappresentare un rischio ecotossicologico per popolazioni di organismi non-target e portare alla comparsa e alla diffusione di resistenza agli antimicrobici (AMR). Per valutare gli effetti in organismi non-target, sono stati selezionati i fluorochinoloni (FQs): due farmaci ad uso veterinario (enrofloxacina e flumechina) ed uno ad uso umano (levofloxacina), utilizzati per test di inibizione dell’allungamento radicale su tre piante terrestri (Lycopersicon esculentum, Lactuca sativa e Daucus carota). Queste dicotiledoni hanno mostrato una limitata sensibilità ai 3 FQs. Per tal motivo, successivi studi sono stati effettuati sull’organismo modello Daphnia magna. Sono stati sviluppati e messi a punto dei test innovativi in grado di evidenziare effetti tossici ritardati in seguito ad esposizione embrionale o neonatale. Si è verificata, inoltre, la modalità di interazione tossicologica dei tre composti in miscele binarie e ternarie. I risultati ottenuti hanno mostrato che i test ufficiali presentano dei limiti, in quanto portano a una sovrastima dell’EC50, e che le miscele di questi composti mostrano un grado di tossicità che si giustifica con interazioni di tipo additivo. Parallelamente, disponendo di nanoparticelle magnetiche ingegnerizzate con flumechina che potrebbero trovare futura applicazione in acquacoltura, è stata saggiata anche la biocompatibilità e l’efficacia terapeutica di questo core-shell nanocarrier, su una coltura di D. magna naturalmente infettatasi con batteri sensibili alla flumechina. Altre attività di ricerca concernenti i FQs hanno rappresentato l’avvio di un progetto di ricerca volto a valutare i possibili effetti epigenetici di flumechina su D. magna. Dai primi risultati sono emersi effetti tossici causati dal farmaco in prima generazione (nanismo armonico, mortalità), fenomeni di letargia e minore responsività alle fonti luminose nelle due generazioni successive non esposte al farmaco. Le analisi biomolecolari, attualmente in corso di svolgimento da parte di altri ricercatori che partecipano al progetto, mirano ad evidenziare eventuali alterazioni del genoma che giustifichino i diversi effetti finora osservati a livello fenotipico. L’altra parte del progetto di tesi ha investigato il fenomeno della diffusione dell’antimicrobico resistenza conseguente ai trattamenti di massa in ambito zootecnico, prendendo in esame le deiezioni degli animali ed i terreni agricoli prima e dopo la fertilizzazione con letami/liquami. Lo scopo di tale progetto è stato quello di valutare le modificazioni nella composizione delle comunità microbiche nelle diverse tipologie di campione mediante Next Generation Sequencing, nonché la presenza e l’abbondanza di geni di antimicrobico resistenza nei confronti di fluorochinoloni, macrolidi, polimixine e β-lattamici, utilizzando Real-Time PCR con SYBRGreen e le curve di melting. A tal fine sono stati impiegati saggi pubblicati in letteratura, ma è anche stato necessario sviluppare dei nuovi saggi per l’identificazione e la quantificazione di geni di resistenza alla colistina (mcr-4 e mcr-5) ed ottimizzare e validare 5 saggi di qPCR, quali ermB, blaCTXM1-like, blaCMY-2, qnrA e qnrS.