Allestimento e caratterizzazione di linee cellulari ottenute da cetacei e loro applicazione nello studio degli effetti indotti dai PFAS

The present thesis reports the successful derivation and characterization of cell lines from skin and muscle tissues of three species of cetaceans: the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus), the Risso’s dolphin (Grampus griseus) and the Cuvier’s beaked whale (Ziphius cavirostris). Primary cells were isolated by enzymatic digestion with papain, cultured in standard mammalian conditions (at 37 ºC and 5% CO2) in cell culture medium consisting of DMEM-F12 supplemented with 10-20% fetal bovine serum (FBS), and immortalized by transfection with pSV3-neo plasmid. Cells were mostly identified as fibroblast as evidenced by their spindle-shape morphology and positive immunoreaction to vimentin. However, we also observed a small portion of cells expressing immunoreaction to cytokeratin in one skin-derived cell line, and desmin in two muscle-derived cell lines, indicating the presence of epithelial and muscle cells respectively. Cells were successfully cryopreserved and thawed, and to date, no reduction in their proliferation capacity has been observed (~30 passages). In general, the obtained cell lines grew in a serum dependent manner, and had population doubling times (PDT) ranging from 39 to 180 h. The second part of the thesis focuses on exploring the effects of per- and polyfluoroalkyl substances (PFAS) on the new established cetacean in vitro models. PFAS are ubiquitous environmental contaminants worldwide. The occurrence and fate of PFAS in the aquatic environment has become one of the emerging problems in environmental chemistry and cetaceans, as top predators, are constantly exposed to many of these compounds that accumulate in different tissues. We assessed the effects of increasing concentrations (0.01-100 µM) of PFOS, PFOA, PFBS, PFBA and the new generation PFAS compound C6O4 on the established cetacean cell lines by means of high content screening (HCS) automated image analysis technology and MTT viability assay. Our results revealed that the tested compounds had significant effects on cell proliferation and viability. We observed response differences between the various cell lines and experimental conditions tested. PFAS-induced changes in the cell cycle were also evaluated in the skin-derived cell line from bottlenose dolphin and in the muscle-derive cell line from Cuvier’s beaked whale. We classified all nuclei into three populations named respectively Normal (nuclei in G0, S and M phase); Large (nuclei showing characteristics of senescence) and Small (nuclei with fragmentation and condensed chromatin) based on the combination of multiple nuclear morphometric parameters and cell cycle analysis. By combining this approach with cell cycle profiling, we determined which phases of the cell cycle were influenced by exposure to PFAS. The results revealed that in the bottlenose dolphin skin-derived cells, PFOS, PFBS and PFBA increased the number of nuclei in the G0 + G1 phase and decreased the number of nuclei in the S phase. Furthermore, PFOS and PFBS reduced the fraction of nuclei in the M phase. Interestingly, the effects of the PFAS compounds tested in this study on bottlenose dolphin skin-derived cells were cell cycle specific, with no drastic effects on overall cell proliferation and viability. In Cuvier’s beaked whale muscle-derived cells, all the tested compounds significantly decreased the number of nuclei in the S and G2 + early M phases, while only PFOS significantly reduced the number of nuclei in the G0 + G1 phase at its highest concentration tested. The cetacean cell models presented in this work provide a new opportunity to assess the potential in vitro effects of aquatic pollutants in deep. This study offers new insights into the general understanding of the cellular effects of PFAS in cetaceans and opens the way for further investigation.

In questo lavoro di tesi viene descritto l’allestimento e la caratterizzazione di cinque linee cellulari ottenute da tessuto muscolare e cute di tre specie di cetacei: il tursiope (Tursiops truncatus), il grampo (Grampus griseus) e lo zifio (Ziphius cavirostris). Le colture primarie ottenute dopo digestione enzimatica con papaina dei tessuti sono state immortalizzate mediante trasfezione con il vettore plasmidico pSV3-neo. La caratterizzazione cellulare ha permesso di identificare cellule esprimenti vimentina identificate come fibroblast-like cellule. È stata caratterizzata anche una piccola percentuale di cellule citocheratina-positive nella linea cellulare di derivazione cutanea, e desmina-positive nelle due linee cellulari di derivazione muscolare, indicando rispettivamente la presenza di cellule epiteliali e muscolari. Le cellule sono state crioconservate e scongelate con successo e, ad oggi, non è stata osservata alcuna riduzione della loro capacità di proliferazione (~ 30 passaggi). In generale, le 5 linee cellulari ottenute sono cresciute in modo siero-dipendente e hanno avuto tempi di raddoppio della popolazione (PDT) compresi tra le 39 e le 180 h. La seconda parte della tesi descrive uno studio volto ad esplorare gli effetti indotti da sostanze per- e polifluoroalchiliche (PFAS) sui nuovi modelli in vitro di cetacei. I PFAS sono contaminanti ambientali presenti in tutto il mondo. La presenza e il destino dei PFAS nell'ambiente acquatico è diventato uno dei problemi emergenti nella chimica ambientale, e i cetacei, in quanto mammiferi predatori, sono costantemente esposti a molti di questi composti che accumulano in diversi tessuti. Sono stati valutati gli effetti dovuti a concentrazioni crescenti (0,01-100 μM) di PFOS, PFOA, PFBS, PFBA e del composto PFAS di nuova generazione C6O4 sulle 5 linee cellulari di cetacei. Lo studio è stato eseguito mediante la messa a punto di un sistema automatizzato basato sull’analisi delle immagini HCS (High Content Screening) e mediante l’analisi della vitalità cellulare con saggio MTT. I risultati hanno rivelato che i composti testati hanno avuto effetti significativi sulla proliferazione e vitalità cellulare. L’analisi combinata dei parametri morfometrici nucleari (intensità, lunghezza e regolarità) e l’analisi del ciclo cellulare ha permesso di classificare tutti i nuclei cellulari in tre popolazioni denominate rispettivamente: popolazione Normal (nuclei in fase G0, S e M); popolazione Large (nuclei che mostrano caratteristiche di senescenza) e popolazione Small (con frammentazione nucleare e cromatina condensata). Infine, mediante analisi statistica multivariata, abbiamo determinato quali fasi del ciclo cellulare fossero alterate dall'esposizione a PFAS. I risultati hanno rivelato che nelle cellule derivate dalla cute del tursiope, PFOS, PFBS e PFBA aumentavano il numero di nuclei nella fase G0 + G1 e diminuivano il numero di nuclei nella fase S. Inoltre, PFOS e PFBS hanno ridotto la frazione di nuclei nella fase M. È interessante notare che gli effetti dei composti PFAS testati sulle cellule derivate dalla cute del tursiope non hanno mostrato effetti significativi sulla proliferazione e vitalità cellulare complessiva. Nelle cellule derivate dal muscolo dello zifio, tutti i composti testati hanno ridotto significativamente il numero di nuclei nelle fasi S e G2 + M iniziale, mentre solo il PFOS ha ridotto significativamente il numero di nuclei nella fase G0 + G1 alla sua massima concentrazione testata (100 μM). I modelli cellulari in vitro di cellule ottenute dai cetacei e presentati in questo lavoro offrono una nuova opportunità per approfondire i potenziali effetti degli inquinanti acquatici. Questo studio offre nuove informazioni sulla comprensione generale degli effetti cellulari dei PFAS nelle cellule dei cetacei e aprendo la strada all’approfondimenti mento di ulteriori indagini sugli effetti degli inquinanti.